大孔樹脂分離純化熟地黃黃酮及其對小鼠運(yùn)動耐力的影響

耿 杰,梅子萍,董功武

(南昌理工學(xué)院,江西南昌 330044)

熟地黃是中藥地黃炮制加工后的成品,為藥食同源物質(zhì),具有補(bǔ)血滋潤、益精填髓功效[1-2],因其富含多糖、梓醇、黃酮、維生素A、氨基酸等化合物,被用作制備牛奶、保健飲料等食品[3-4]。其中的黃酮類化合物是一類含氧雜環(huán)的天然有機(jī)物,具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、快速消除體內(nèi)氧自由基,增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)身體疲勞導(dǎo)致的運(yùn)動耐力下降,與體內(nèi)氧自由基的快速增多,造成體內(nèi)線粒體呼吸鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)過程受損有關(guān),上述過程使得細(xì)胞能量合成發(fā)生障礙,影響肌纖維收縮功能,出現(xiàn)組織損傷、肌肉收縮能力下降等現(xiàn)象,而對機(jī)體補(bǔ)充外源性抗氧化劑是增強(qiáng)運(yùn)動耐力的有效方法之一[7-8]。

目前熟地黃中已知化學(xué)成分的體內(nèi)、外抗氧化研究,集中于辛梓醇或多糖化合物,對其黃酮類化合物的研究卻鮮有公開。雖有文獻(xiàn)報道,超聲或酶法提取熟地黃黃酮,但產(chǎn)物的純度較低[9-10],可能影響其功效的發(fā)揮。大孔樹脂吸附分離,綜合機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的優(yōu)點(diǎn),具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn),已被大量用于天然產(chǎn)物有效成分的分離與純化[11-12]。因此,本研究在提取工藝研究基礎(chǔ)上,探討大孔樹脂純化熟地黃黃酮化合物的最佳工藝條件,并考察其對動物運(yùn)動耐力的影響,為熟地黃后期開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熟地黃、西洋參 購置于江西昌盛大藥房;西洋參膠囊(規(guī)格:0.5 g/粒) 金日制藥(中國)有限公司;蘆丁對照品(UV>92.4%,含量測定用) 中國藥品生物制品檢定研究院;無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、肝糖原(HG)檢測試劑盒 南京信帆生物有限公司;試驗(yàn)用水 為二次純化水;健康雄性昆明系小鼠 100只,體質(zhì)量15～22 g,江西省實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:SYXK 2018-0006),生長環(huán)境溫度20～25 ℃,相對濕度50%～70%。

721型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;ME104型電子天平 梅特勒-托利多公司;JY96-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海熙揚(yáng)儀器有限公司;PR-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀普瑞科技有限公司;VFD-1000A型冷凍干燥箱 上海舜制儀器制造有限公司;TD4型高速離心機(jī) 鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZWY-110X50型恒溫振蕩器 北京海天友誠科技有限公司;AB-8、H-103、D-101、DM301大孔樹脂 天津西金納環(huán)保材料科技有限公司;HPD 400、DM-130大孔樹脂 河北寶恩化工有限公司;動物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物制備 參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[9],熟地黃經(jīng)60 ℃干燥至恒重后粉碎,過60目篩,準(zhǔn)確稱取25 g過篩樣品,置于500 mL 75%乙醇溶液內(nèi),于135 W功率超聲波下提取45 min,離心后的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,經(jīng)冷凍干燥即得熟地黃總黃酮粗品,備用。

1.2.2 黃酮含量測定 參考文獻(xiàn)方法[10],以標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下:y=3.125x+0.0136(R2=0.9982),表明蘆丁濃度在0.04～0.4 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,同時于510 nm波長下測定樣品的吸光度值,平行測定五次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得到樣品溶液中黃酮質(zhì)量濃度,通過下式計(jì)算樣品含量。

式(1)

式中m0為熟地黃樣品質(zhì)量,mg;c為產(chǎn)物的黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品溶液體積,mL;D為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 樹脂類型選擇 準(zhǔn)確稱取5.0 g極性不同的預(yù)處理后的六種大孔樹脂(AB-8、H-103、D-101、DM301、HPD 400、DM-130)置于錐形瓶內(nèi)[13],分別加入5 mg/mL 50 mL提取液后,置于恒溫振蕩器內(nèi),靜態(tài)吸附12 h后過濾,測得吸附后濾液中總黃酮的質(zhì)量濃度,通過下式計(jì)算不同型號大孔樹脂的吸附率[14]。

式(2)

式中:m0為提取液中總黃酮質(zhì)量,mg;me為飽和吸附后濾液中總黃酮質(zhì)量,mg;Qe為飽和吸附率,%。

將飽和吸附后的樹脂置于錐形瓶內(nèi),加入100 mL 80%乙醇溶液后,置于恒溫振蕩器中,靜態(tài)洗脫12 h,過濾,測定濾液中總黃酮的濃度,通過下式計(jì)算不同型號樹脂的洗脫率與回收率[15]。

(3)

式(4)

式中:m0為提取液中總黃酮質(zhì)量,mg;me為飽和吸附后濾液中總黃酮質(zhì)量,mg;md為洗脫液中總黃酮質(zhì)量,mg;Dd為洗脫率,%;R為回收率,%。

1.2.4 動態(tài)吸附與洗脫條件考察

1.2.4.1 不同吸附工藝條件影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH、上樣流速及上樣液體積對吸附率的影響,具體如下:當(dāng)上樣液pH為5.0,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL時,上樣液質(zhì)量濃度分別為:2、4、6、8、10 mg/mL;當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為8 mg/mL,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL時,上樣液pH分別為:3、4、5、6、7;當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為8 mg/mL,上樣液pH為5.0時,考察不同上樣流速(0.5、1.0、2.0 mL/min)的樹脂泄漏曲線。

1.2.4.2 不同洗脫工藝條件影響 以乙醇溶液作洗脫液,分別考察洗脫液濃度、洗脫流速和洗脫液體積對洗脫率的影響,具體如下:當(dāng)洗脫流速為1 mL/min,洗脫液體積為150 mL時,洗脫液濃度分別為:50%、60%、70%、80%、90%;當(dāng)洗脫液濃度為80%時,考察不同洗脫流速(1、2、3 mL/min)的樹脂洗脫曲線。

1.2.5 動物運(yùn)動耐力研究 100只小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)平均分為5組,每組20只,分別為空白對照組(BG)、陽性對照組(PG)和低(L-FG)、中(M-FG)、高(H-FG)劑量的純化產(chǎn)物組,參考相關(guān)文獻(xiàn)的用量設(shè)計(jì)[16-17],確定空白對照組灌胃生理鹽水0.1 mL/g·bw(以體質(zhì)量計(jì),下同);陽性對照組則灌胃西洋參膠囊內(nèi)西洋參粉0.10 mg/g·bw;低、中、高劑量組則分別灌胃0.05、0.10、0.15 mg/g·bw的黃酮純化產(chǎn)物,每只小鼠每天灌胃一次,結(jié)束后休息30 min,開展游泳訓(xùn)練,連續(xù)30 d,研究期間各組動物的喂食與飲水正常進(jìn)行。

1.2.5.1 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 第30 d灌胃結(jié)束30 min后,每組隨機(jī)選取10只小鼠于尾部負(fù)重自身5%體質(zhì)量的重物,開展負(fù)重游泳試驗(yàn),記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時間,作為力竭游泳運(yùn)動時間[18]。

1.2.5.2 運(yùn)動耐力評價指標(biāo)測定 每組剩余10只動物于第30 d灌胃結(jié)束后30 min,進(jìn)行不負(fù)重游泳運(yùn)動30 min,隨后取出擦凈,放回鼠籠休息10 min后,摘取眼球,抽血離心,收集血清,同時分取肝與肌肉組織,利用相關(guān)試劑盒,分別測得不同組別小鼠肝臟中肝糖原濃度、肌肉中肌糖原濃度和血清中乳酸、尿素氮濃度[19]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

相關(guān)評價指標(biāo)均采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述,利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,當(dāng)P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物粗黃酮含量

按照1.2.2操作步驟,測定提取物樣品溶液于510 nm波長處吸光度值,并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到提取物中總黃酮含量為2.52%±0.10%。

2.2 樹脂型號選擇

表1為不同極性大孔樹脂的靜態(tài)吸附率、洗脫率和回收率比較,從表1可見,各種型號樹脂對熟地黃黃酮的吸附能力不同,其中H103大孔樹脂的吸附率最大,達(dá)到86.6%,其次為D101大孔樹脂,而D101大孔樹脂對目標(biāo)產(chǎn)物的靜態(tài)洗脫率略大于H103樹脂,但考慮H103大孔樹脂的回收率更高,因此確定H103大孔樹脂作為熟地黃黃酮提取物的純化樹脂。

表1 不同樹脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較(n=5)

2.3 吸附工藝條件考察

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率影響 上樣液質(zhì)量濃度過大,會引起樹脂的堵塞與泄露,而濃度過低,又影響吸附效率,為此分別考察不同上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響,結(jié)果見圖1。隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大,樹脂對黃酮的吸附率不斷升高,至8 mg/mL開始下降,因此確定最佳上樣液質(zhì)量濃度為8 mg/mL。

圖1 上樣液濃度對吸附率的影響

2.3.2 上樣液pH對吸附率影響 當(dāng)黃酮類化合物呈分子態(tài)時,與樹脂的相互作用較好,而溶液pH可能影響目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),為此分別考察不同上樣液的pH對吸附率的影響,結(jié)果見圖2。當(dāng)上樣液pH為5時,樹脂對黃酮類化合物的吸附率達(dá)到最大,這歸因于在弱酸性溶液中黃酮類化合物的羥基既不易于生成“徉鹽”,也不易于形成離子態(tài)結(jié)構(gòu)[20],因此確定最佳上樣液pH為5。

圖2 上樣液pH對吸附率的影響

2.3.3 不同上樣流速的樹脂吸附泄漏曲線 若上樣流速過快,且上樣液體積過大,不僅使得目標(biāo)產(chǎn)物不能與樹脂充分接觸,也可能容易造成樹脂過載而泄露,為此分別考察不同上樣流速的樹脂吸附泄露曲線,結(jié)果見圖3。通常將流出液中目標(biāo)化合物的濃度達(dá)到10%上樣液質(zhì)量濃度,認(rèn)定為樹脂吸附泄漏點(diǎn)[21],從圖3可見,隨著上樣流速的增大,達(dá)到樹脂吸附泄漏點(diǎn)的上樣液體積不斷降低,當(dāng)上樣流速為1 mL/min時,樹脂的吸附率和達(dá)到樹脂吸附泄露點(diǎn)的上樣液體積最大,但考慮實(shí)際工業(yè)應(yīng)用的吸附效率,確定最佳上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL。

圖3 不同上樣流速的樹脂吸附泄露曲線

2.4 洗脫工藝條件考察

2.4.1 洗脫液濃度對洗脫率影響 洗脫液的濃度影響其極性強(qiáng)弱,進(jìn)而影響對目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫效果,為此分別考察不同濃度乙醇溶液對目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫率影響,結(jié)果見圖4。洗脫液乙醇對熟地黃總黃酮的洗脫率隨著洗脫劑的濃度增大呈先升高后降低的趨勢,當(dāng)洗脫液濃度為80%時,極性較弱,與目標(biāo)產(chǎn)物的作用力較強(qiáng),但當(dāng)濃度過高時,吸附在樹脂上的其它雜質(zhì)將與目標(biāo)產(chǎn)物競爭結(jié)合,使得洗脫率下降,因此確定洗脫液乙醇的最佳濃度為80%。

圖4 洗脫液濃度對洗脫率的影響

2.4.2 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線 圖5為不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線,從圖5可知,隨著洗脫流速的增大,曲線的拖尾現(xiàn)象較為明顯,且峰型逐漸變寬,當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時,洗脫曲線峰型較為尖銳、單一和對稱,因此確定最佳洗脫流速為1 mL/min,洗脫體積用量為150 mL。

圖5 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線

2.5 最佳純化工藝驗(yàn)證

照上述最佳純化工藝條件,即pH為5.0,質(zhì)量濃度為8 mg/mL上樣液60 mL,以2 mL/min流速,上樣至H103大孔樹脂飽和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫,測得吸附率與洗脫率分別為85.7%和90.2%,產(chǎn)物的總黃酮含量由純化前2.52%±0.10%提高至純化后12.18%±1.69%,約為純化前4.8倍,而劉宛玲等采用大孔樹脂純化麥胚中總黃酮,產(chǎn)物含量約為純化前12.26倍[22];李玉娟等采用大孔樹脂純化瑪咖總黃酮,產(chǎn)物含量為約為純化前5.6倍[23],表明該工藝分離效果較好,適于熟地黃黃酮類化合物的純化。

2.6 負(fù)重游泳時間比較

負(fù)重游泳是常見評估機(jī)體運(yùn)動耐力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?具有較好的重現(xiàn)性,小鼠在負(fù)重游泳時,肌肉消耗糖原,血糖水平下降,使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)供能不足,導(dǎo)致全身性疲勞產(chǎn)生,影響運(yùn)動耐力[24],利用該模型考察不同劑量純化產(chǎn)物對小鼠的負(fù)重游泳時間長短的影響,結(jié)果見圖6所示。

圖6 純化產(chǎn)物對小鼠力竭游泳時間影響

從圖6可知,與空白對照組(BG)相比,陽性對照組(PG)與三個黃酮純化產(chǎn)物組(L-FG、M-FG、H-FG)的力竭游泳運(yùn)動時間均有延長,延長率分別為13.7%、4.0%、8.1%、12.1%。其中低劑量組與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),而中(M-FG)、高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)與空白組對比具有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮的純化產(chǎn)物可延長小鼠運(yùn)動時間,提高其運(yùn)動耐力。

2.7 運(yùn)動后體內(nèi)生化指標(biāo)比較

2.7.1 乳酸濃度比較 血糖是提供機(jī)體運(yùn)動能量的主要來源之一,當(dāng)機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動后會造成體內(nèi)部分細(xì)胞缺氧,致使血糖發(fā)生糖酵解反應(yīng)生成乳酸,蓄積在骨骼肌等組織中,出現(xiàn)四肢酸痛,影響機(jī)體耐力[25],因此分別測定運(yùn)動后不同組別小鼠的體內(nèi)乳酸含量,結(jié)果見圖7所示。

圖7 純化產(chǎn)物對小鼠乳酸濃度影響

從圖7可知,三個黃酮純化產(chǎn)物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內(nèi)乳酸濃度分別比空白對照組(BG)降低4.7%、14.0%、19.8%,其中低劑量組(L-FG)的小鼠體內(nèi)乳酸濃度與空白對照組(BG)相比,有顯著性差異(P<0.05),而中劑量組(M-FG)、高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)的動物體內(nèi)乳酸濃度均極顯著低于空白對照組(P<0.01),顯示熟地黃黃酮的純化產(chǎn)物可加快運(yùn)動后體內(nèi)的乳酸代謝,達(dá)到提高運(yùn)動耐力的目的。

2.7.2 尿素氮濃度比較 當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動,血糖供應(yīng)不足時,體內(nèi)蛋白質(zhì)將加快分解利用,血清中尿素氮濃度持續(xù)升高[26],因此將體內(nèi)尿素氮濃度作為間接反映機(jī)體運(yùn)動耐力的指標(biāo),運(yùn)動后不同組別動物體內(nèi)尿素氮濃度的比較,見圖8所示。

圖8 純化產(chǎn)物對小鼠尿素氮濃度影響

從圖8可知,三個不同劑量黃酮純化產(chǎn)物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內(nèi)尿素氮濃度分別與空白對照組(BG)相較,下降2.0%、4.2%、7.5%,與空白對照組動物體內(nèi)的尿素氮濃度相較,低劑量組(L-FG)無顯著性差異(P>0.05),中劑量組(M-FG)有顯著性差異(P<0.05),而高劑量組(H-FG)與陽性對照組(PG)有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮純化產(chǎn)物有利于在機(jī)體運(yùn)動時,減少體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用。

2.7.3 肝、肌糖原濃度比較 肝糖原與肌糖原是機(jī)體的重要儲能物質(zhì),當(dāng)體內(nèi)血糖不能維持高強(qiáng)度運(yùn)動時,兩種糖原先后各自分解成葡萄糖,以維持體內(nèi)血糖水平[27],黃酮純化產(chǎn)物對運(yùn)動后不同組別小鼠的肝、肌糖原濃度影響,見圖9所示。

圖9 純化產(chǎn)物對小鼠肝、肌糖原濃度影響

從圖9可知,與空白對照組(BG)相比,陽性對照組(PG)和三個黃酮純化產(chǎn)物組(L-FG、M-FG、H-FG)的動物體內(nèi)肝、肌糖原濃度均有提高,其中低劑量組(L-FG)、中劑量組(M-FG)的小鼠體內(nèi)肝、肌糖原濃度與空白對照組(BG)相比,有顯著性差異(P<0.05),而高劑量組(H-FG)、陽性對照組(PG)與其有極顯著性差異(P<0.01),表明熟地黃黃酮純化產(chǎn)物有助于提高體內(nèi)的肝、肌糖原儲備,延長運(yùn)動時間。

3 結(jié)論

本研究探討了大孔樹脂純化熟地黃黃酮的最佳工藝條件,當(dāng)pH為5.0,質(zhì)量濃度為8 mg/mL上樣液60 mL,以2 mL/min流速,上樣至H103大孔樹脂飽和吸附后,采用150 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫時,產(chǎn)物的總黃酮含量由2.52%提高至12.18%,約為純化前4.8倍,表明該最佳工藝操作簡便、純化效率較高。同時,動物實(shí)驗(yàn)表明,中、高劑量的黃酮純化產(chǎn)物均有利于加快體內(nèi)乳酸代謝,減少尿素氮生成,并利于提高體內(nèi)肝糖原與肌糖原的儲備,從而明顯增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動耐力。因此,本研究對熟地黃總黃酮的純化及后期深度開發(fā)具有指導(dǎo)意義。