不同品種紫薯抗氧化物質(zhì)及體外抗氧化活性比較

黃 彪,韋 航,李國(guó)良,何明燕,吳建鴻,林香信,*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,福建福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350003；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,福建福州 350003)

紫薯,因其塊根肉質(zhì)部分成紫色而得名。紫薯營(yíng)養(yǎng)成分豐富,含有淀粉[1]、多糖[2]、氨基酸[3-4]、多酚[5-7]、黃酮[5,8]、花色苷[9-11]和花青素[12]等多種物質(zhì),其中的多酚、黃酮、花青素等成分經(jīng)研究表明具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血壓等活性功能[13-16]。紫薯豐富的營(yíng)養(yǎng)功能成分使其在食品加工和保健食品開發(fā)等方面具有一定應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。隨著紫薯系列產(chǎn)品加工的多樣化,紫薯的消費(fèi)量也不斷增加。為滿足市場(chǎng)需求,推進(jìn)紫薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展,加快紫薯種質(zhì)資源的創(chuàng)新與選育,近年來(lái)我國(guó)一些地區(qū)如浙江、福建、廣東、廣西、安徽、海南等地方的科研院所陸續(xù)開展了紫薯種質(zhì)資源的創(chuàng)新和選育的工作[17-19],并在相關(guān)工作中注重了相關(guān)品種的加工開發(fā)利用[20-21]。近年來(lái)在相關(guān)研究方面更注重了營(yíng)養(yǎng)功能成分(如多酚、花青素、胡蘿卜素)強(qiáng)化型甘薯品種[22-24],系列鮮食及食品加工型品種的選育與創(chuàng)新[25],相關(guān)工作取得了較好的進(jìn)展。

福建地處我國(guó)東南沿海,氣候條件屬于亞熱帶氣候,適宜的自然條件為紫薯新品種的選育及種植推廣提供了基礎(chǔ),優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性好的新品種甘薯,尤其是紫薯的品種創(chuàng)新是福建甘薯研究創(chuàng)新的重要方向。在紫薯研究方面,培育出了龍紫4號(hào)、龍紫6號(hào)、莆紫薯3號(hào)、莆紫薯18號(hào)、福寧紫3號(hào)、福薯24號(hào)等多個(gè)紫薯品種,為新品種的選育與應(yīng)用提供了新材料,促進(jìn)了紫薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究以福建產(chǎn)區(qū)的主栽紫薯品種為研究對(duì)象,重點(diǎn)分析了7份不同品種紫薯抗氧化功能性成分如總酚、總黃酮、花色苷及花青素含量,并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了比較,以期為紫薯新品種的選育及紫薯產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

7份供試紫薯樣品龍紫4號(hào)、龍紫6號(hào)(福建龍巖)、莆紫3號(hào)、莆紫18號(hào)(福建莆田)、福寧紫3號(hào)、福寧紫4號(hào)(福建寧德)、福薯24號(hào)(福建莆田) 均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供；沒食子酸、蘆丁、飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素 純度均大于97%,南京道斯夫生物技術(shù)股份限公司；甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純,美國(guó)Fisher公司；二苯基苦基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵、水楊酸、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過(guò)硫酸鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、碳酸鈉、無(wú)水乙醇等 均為分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Wates e-2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；Millipore Direct-Q5超純水儀 美國(guó)Millipore公司；SYG-2水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；IKA T 25樣品均質(zhì)器 德國(guó)IKA公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯樣液的提取

1.2.1.1 紫薯總酚、總黃酮、總花色苷分析樣液的提取 參考孫海燕[6]、蔡湛等[8]的方法。稱取1.000 g磨碎的紫薯鮮樣置于棕色玻璃管中,加入10 mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振蕩提取30 min,自然冷卻至室溫,將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中,于5000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min,離心結(jié)束后上清液全部轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶,殘?jiān)偌尤?0 mL含有0.1%鹽酸的74%的乙醇溶液重復(fù)以上操作提取2次,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,用去離子水定容到10 mL,4 ℃條件下冷藏備用。

1.2.1.2 紫薯花青素組分分析樣液的提取 參照NY-T 2640-2014植物源性食品中花青素的測(cè)定(高效液相色譜法)。稱取樣品5.000 g于具塞比色管中,加溶劑(無(wú)水乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶1,V/V)定容至25 mL,超聲功率300 W常溫條件下提取30 min。超聲提取后,沸水浴恒溫90 ℃水解1 h,取出冷卻至室溫,再用溶劑定容至25 mL。靜置,取上清液置于離心管中,5000 r·min-1離心5 min,0.45 μm水相濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1.2.1.3 紫薯自由基清除實(shí)驗(yàn)樣液提取 稱取5.000 g磨碎的紫薯鮮樣置于棕色玻璃管中,加入5 mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振蕩提取30 min,自然冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至離心管中,于5000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min,離心結(jié)束后上清液全部轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶,殘?jiān)偌尤? mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液重復(fù)以上操作提取2次,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,用去離子水定容到10 mL,4 ℃條件下冷藏備用。

1.2.2 測(cè)定方法

1.2.2.1 總酚的測(cè)定 總酚測(cè)定采用福林酚比色法[26],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)。配制1000 mg·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用移液管分別移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中,分別用水定容至刻度,搖勻,得到濃度分別為20、40、60、80、100、200 mg·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用移液管分別移取沒食子酸工作液、水(作空白對(duì)照用)及測(cè)試液各1.0 mL于25 mL刻度比色管內(nèi),在每個(gè)試管內(nèi)分別加人5.0 mL的福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑,搖勻,反應(yīng)5 min,繼續(xù)加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,再加水定容、搖勻,室溫放置60 min后于765 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)沒食子酸工作液的濃度與吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=3.97x-0.008,R2=0.9991),并根據(jù)測(cè)試液的吸光值計(jì)算樣品中含量。

1.2.2.2 總黃酮的測(cè)定 總黃酮含量的測(cè)定照Dewanto等[27]報(bào)道的方法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)。配制200 mg·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,加純水至10 mL,再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的Al(NO3)3溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min后再加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液20 mL,混勻,用分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取測(cè)試液10 mL于比色管中,以去離子水進(jìn)行空白對(duì)照,按照上述相同的測(cè)定步驟依次加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、氫氧化鈉溶液混勻后于510 nm處測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=3.454x-0.007,R2=0.9995)計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.2.2.3 總花色苷的測(cè)定 采用pH示差法[28-29]測(cè)定總花色苷含量。取KCl緩沖溶液(0.025 mol·L-1,pH1.0)和CH3COONa緩沖溶液(0.400 mol·L-1,pH4.5)各9.0 mL,將測(cè)試液1.0 mL分別加入其中,用去離子水作為空白對(duì)照,分別測(cè)定其在520、700 nm下的吸光度(A)。提取液花色苷含量按下式計(jì)算:

A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5

花色苷大都以糖苷的形式存在,消光系數(shù)與分子量Mw以矢車菊素葡萄糖苷計(jì),Mw=449.2,ε=26900,DF為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.2.4 花青素組分的測(cè)定 花青素組分的測(cè)定采用超高效液相色譜法(HPLC),參考標(biāo)準(zhǔn)NY-T 2640-2014液相色譜條件。色譜柱:Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm,2.7 μm)；柱溫:35.0 ℃；檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng):530 nm；流速:0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量:5 μL；流動(dòng)相A為含1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為含1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序如表1所示。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.2.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定 配制0.1 mmol·L-1的DPPH溶液,取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測(cè)試液0.5 mL分別加入2.0 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液,暗處反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以無(wú)水乙醇代替樣品為空白對(duì)照,于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)0。用無(wú)水乙醇代替DPPH溶液,測(cè)定2.0 mL無(wú)水乙醇與1.0 mL樣品稀釋液混合后在517 nm處的吸光值A(chǔ)2。每組做3個(gè)重復(fù),求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.6 OH自由基清除能力測(cè)定 取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測(cè)試液0.5 mL,分別加入1.0 mL 6mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液和1.0 mL 10 mmol·L-1的水楊酸-乙醇,再加入1.0 mL 6 mmol·L-1雙氧水用以啟動(dòng)反應(yīng),用振蕩器混合均勻,于37 ℃水浴10 min,在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定空白對(duì)照,于波長(zhǎng)510 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)0。用無(wú)水乙醇代替水楊酸-乙醇溶液,測(cè)定2.0 mL無(wú)水乙醇與1.0 mL樣品稀釋液混合后在510 nm處的吸光值A(chǔ)2,每組做3個(gè)重復(fù),求平均值。

OH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.7 ABTS自由基清除能力測(cè)定 配制ABTS和K2S2O8的混合溶液,混合溶液中ABTS和K2S2O8的最終濃度分別為7.0、2.5 mmol·L-1,將混合液室溫避光條件下靜置12～16 h。實(shí)驗(yàn)之前,將其用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋,直到稀釋液在波長(zhǎng)734 nm條件下的吸光度值為0.70左右,得到ABTS工作液。取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測(cè)試液0.5 mL,加入ABTS反應(yīng)液2.0 mL,50%甲醇2.5 mL,混勻,6 min后于734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定空白對(duì)照,于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)0。以磷酸緩沖液代替ABTS工作液,測(cè)定2.0 mL磷酸緩沖液與1.0 mL樣品稀釋液在517 nm處的吸光值A(chǔ)2,每組3個(gè)重復(fù),求平均值。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)；DPS 7. 05進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫薯中總酚、總黃酮、花色苷含量比較

新鮮紫薯樣品中的總酚、總黃酮、總花色苷含量如表2所示,不同品種紫薯總酚、總黃酮及總花色苷的含量表現(xiàn)出一定的差別。紫薯樣品中總酚含量為0.91～1.97 mg·g-1,福寧紫3號(hào)、龍紫4號(hào)紫薯總酚含量較高,分別為(1.97±0.03)、(1.64±0.02) mg·g-1,均極顯著高于其他品種(P<0.01)；而福薯24號(hào)和蒲紫18號(hào)紫薯樣品中總酚含量相對(duì)較低,兩者不存在顯著性差異,但是極顯著低于其他品種(P<0.01)。紫薯樣品中總黃酮含量為0.32～1.20 mg·g-1,福寧紫3號(hào)、龍紫4號(hào)紫薯樣品中總黃酮含量相對(duì)于其他品種較高,分別為(1.20±0.02)、(0.93±0.03) mg·g-1,顯著高于其他品種(P<0.05)；福寧紫4號(hào)、福薯24號(hào)、莆紫3號(hào)及莆紫18號(hào)樣品中的總黃酮含量較低,且它們之間無(wú)顯著性差異。紫薯樣品中總花色苷含量為0.45～0.70 mg·g-1,總花色苷含量最高的品種為福寧紫3號(hào)和龍紫6號(hào),分別為(0.70±0.02)、(0.66±0.01) mg·g-1,極顯著高于其他品種(P<0.01),花色苷含量最低的為莆紫18號(hào)、福薯24號(hào),兩者不存在顯著性差異,但是極顯著低于其他品種(P<0.01)。

表2 不同品種紫薯中總酚、總黃酮和總花色苷含量(鮮重)

表3 6種花青素組分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表4 不同紫薯花青素組分含量(mg·kg-1,n=3)

2.2 不同品種紫薯花青素含量比較

6種花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品的HPLC如圖1、圖2所示。以標(biāo)液各組分質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)(μg·mL-1)、色譜峰面積Y為縱坐標(biāo),得到各組分的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組分峰面積和濃度線性關(guān)系良好,回歸方程的相關(guān)系數(shù)r均大于0.995(表3)。

圖1 6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

圖2 紫薯樣品的HPLC圖

從表4可以得知,紫薯中花青素組分主要為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素。福寧紫3號(hào)紫薯樣品中花青素含量較高,龍紫4號(hào)、福薯24號(hào)和莆紫18號(hào)紫薯樣品中的花青素含量則相對(duì)較低。不同紫薯樣品中,花青素組分的組成不盡相同。如在花青素含量較高的福寧紫3號(hào)和龍紫6號(hào)紫薯樣品中,花青素組分含量高低依次為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素；而在福寧紫4號(hào)紫薯樣品中,花青素組分含量高低順序則為芍藥色素/矢車菊色素、飛燕草色素。在分析的樣品中,含量最高的花青素為芍藥色素,其次為飛燕草素；這兩者在福寧紫3號(hào)紫薯樣品中的含量均極顯著高于其他品種(P<0.01)。

對(duì)照表2、表4紫薯中花色苷和花青素的含量,可得知花色苷含量較高的品種,花青素的含量也較高,但不同紫薯花青素組分的比例有所不同?；ㄉ帐峭ㄟ^(guò)花青素與糖苷結(jié)合而形成,通過(guò)對(duì)花色苷進(jìn)行水解得到花青素,運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)不同品種紫薯樣品進(jìn)行分析,可以得知紫薯樣品中主要的花青素組分為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素,這與Terahara、韓豪等的報(bào)道一致[30-31]。但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)不同品種紫薯花青素組分的確定及含量相關(guān)研究還不多。劉超等[12]利用高效液相色譜法對(duì)不同品種紫甘薯中花色素進(jìn)行分析,得到多種單體含量,但鑒于花青素單體較為復(fù)雜,在研究中未完全確定紫薯中具體花青素成分。而韓豪等[31]則是通過(guò)超高效液相色譜三重四級(jí)桿-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)定性分析了紫薯樣品中的花色苷組成,確定了紫薯花色苷中與糖苷結(jié)合的花青素單體有芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素等?；ㄇ嗨厥且活惥哂辛己每寡趸⒖鼓[瘤、消炎抑菌功能活性的成分,可以作為天然色素用于食品加工業(yè)上的著色劑和食品防腐劑,也可用于化妝品行業(yè)用于增色劑,在食品、藥品及化妝品行業(yè)有著廣泛的用途[32-33]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)福建產(chǎn)區(qū)主要品種紫薯花青素進(jìn)行測(cè)定比較,對(duì)于紫薯類食品及功能保健產(chǎn)品開發(fā)具有一定的參考價(jià)值。

2.3 不同品種紫薯體外抗氧化活性比較

2.3.1 不同品種紫薯清除DPPH自由基活性比較 由圖3可以得出,測(cè)試的7種紫薯中,福寧紫3號(hào)和龍紫4號(hào)紫薯樣品提取液的DPPH自由基清除率較高,對(duì)DPPH清除率分別可達(dá)到88.4%和83.8%,極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而福薯24號(hào)的DPPH自由基清除為61.7%,極顯著低于其他品種紫薯樣品(P<0.01)。

圖3 不同品種紫薯DPPH自由基清除活性比較

2.3.2 不同品種紫薯清除OH自由基活性比較 由圖4可以得出,福寧紫3號(hào)紫薯和龍紫4號(hào)紫薯樣品提取液的OH由基清除率高,分別達(dá)到49.1%和42.4%,極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而莆紫18號(hào)和福薯24號(hào)的DPPH清除率分別為29.9%和31.4%,極顯著低于其他品種紫薯(P<0.01)。

圖4 不同品種紫薯OH自由基清除活性比較

2.3.3 不同品種紫薯清除ABTS自由基活性比較 ABTS與K2S2O8反應(yīng)生成自由基陽(yáng)離子,在抗氧化劑存在下,自由基陽(yáng)離子與之反應(yīng),變成沒有顏色的ABTS。根據(jù)樣品溶液吸光度的變化,計(jì)算自由基清除活性。由圖5可以得出,福寧紫3號(hào)紫薯和龍紫4號(hào)紫薯樣品提取液的ABTS自由基清除活性較高,清除率分別為90.1%和85.1%,均極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而莆紫18號(hào)和福薯24號(hào)的清除率分別為71.7%和72.8%,極顯著低于其他品種紫薯樣品(P<0.01)。

圖5 不同品種紫薯ABTS自由基清除活性比較

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)福建產(chǎn)區(qū)7個(gè)不同品種紫薯活性成分如總酚、總黃酮、總花色苷和花青素組分進(jìn)行比較,并對(duì)不同品種紫薯體外抗氧化活性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,福寧紫3號(hào)紫薯中活性成分如總酚、總黃酮、總花色苷、花青素含量均為最高,對(duì)自由基表現(xiàn)出最好的清除活性；所分析的紫薯樣品中含有的主要花青素組分為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素,其中福寧紫3號(hào)紫薯中的花青素含量最高,莆紫18號(hào)紫薯中的花青素含量則最低。本研究結(jié)果可為紫薯的品種選育及應(yīng)用提供一定的參考,為紫薯類產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供相關(guān)參考依據(jù)。