靜電紡明膠/殼聚糖可食用納米纖維膜的制備、表征及其抑菌特性研究

劉旖旎,許曉曦,劉 芳,孫芝蘭,吳海虹

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

由微生物引起的食品腐敗變質(zhì)一直嚴(yán)重威脅著食品安全,肉制品作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源,有適宜微生物生長(zhǎng)的環(huán)境條件,在生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中極易受到腐敗菌的污染[1-2]。包裝作為食品的屏障,對(duì)食品的保護(hù)起到了至關(guān)重要的作用。隨著人們食品安全意識(shí)的提高,無(wú)毒害包裝材料的需求也日益增大。殼聚糖(Chitosan)是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物,具有無(wú)毒、可降解、生物多功能性及生物相容性等特點(diǎn),但力學(xué)性能差、氣體阻隔性能弱、不具有耐水性等缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用,不能獨(dú)立作為包裝材料[3]。明膠(Gelatin)是動(dòng)物皮膚、骨頭、筋腱等結(jié)締組織中的膠原蛋白經(jīng)過(guò)酸法或堿法水解得到的一種具有很好的生物相容性和可降解性的衍生蛋白質(zhì),但因?yàn)槊髂z易在低溫條件下自動(dòng)凝膠,很難在水溶液中電紡[4]。關(guān)于殼聚糖和明膠的功能性質(zhì)以及在食品抗菌包裝中的應(yīng)用已有多年的研究,因?yàn)槊髂z的易凝膠性和殼聚糖的易水解性等缺陷使其在食品包裝過(guò)程中的應(yīng)用受到了極大限制,因此通過(guò)靜電紡絲技術(shù)在發(fā)揮兩者的優(yōu)勢(shì)的同時(shí)避免其缺陷,以提高明膠和殼聚糖在食品包裝中的應(yīng)用。

圖1 靜電紡絲抗菌膜制作流程圖

靜電紡絲通過(guò)高壓靜電場(chǎng),將高聚物溶液或者熔融高聚物牽伸為納米纖維[5-6]。與流延法等普通方法相比,靜電紡絲通過(guò)高壓靜電場(chǎng)將明膠和殼聚糖結(jié)合在一起,突出殼聚糖的抑菌效果的同時(shí)解決了易溶于水等問(wèn)題。近幾年的一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖單獨(dú)紡絲[7]及包埋納米銀離子[8],納米鋅離子[9]、植物提取物[10-11]、酶制劑[12-13]等均有明顯的抑菌效果,以明膠作為載體加入生物活性物質(zhì)及化學(xué)抑菌劑制成的電紡膜對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等抑菌效果顯著[14],在醫(yī)用支架[15-16]、保鮮[17]、抑菌[18]、傷口敷料[19]等方面有廣泛應(yīng)用。但是目前電紡材料的抗菌劑多為化學(xué)抗菌劑,雖然達(dá)到了抑菌效果,但是無(wú)法保證其可食用性[19-20]。

因此本試驗(yàn)以明膠為載體,殼聚糖為天然抗菌劑制備不同配比的可食用納米抗菌膜,并對(duì)其進(jìn)行熱力學(xué)分析、物相分析、形態(tài)觀察、抑菌效果等研究,以得出明膠與殼聚糖的最佳配比,制作新型的、可食用的抗菌包裝材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌Q2、克雷伯氏菌K4、肺炎克雷伯氏菌K9、沙門(mén)氏菌S6 為實(shí)驗(yàn)室從新鮮雞肉中分離鑒定并保存;營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth,NB) 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI) 北京陸橋;明膠(分子量:1000～7000) 天津科密歐試劑有限公司;殼聚糖(粘度:100～200 mPa·s) 脫乙酰度≥95%,麥克林公司;冰乙酸(分子量:60.65) 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司。

EXSTAR series TG/DTA7200熱重分析儀 日本SII Nano Technology Inc公司;DP30靜電紡絲儀 天津云帆科技有限公司;Physica MCR301流變儀 奧地利安東帕公司;PE(Ultra View VOX)轉(zhuǎn)盤(pán)式激光共聚焦顯微鏡 美國(guó)鉑金埃爾默股份有限公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司股份公司;Bio Photo meter plus核酸蛋白測(cè)定儀、22331臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司;酶標(biāo)儀 美國(guó) BioTek Instruments有限公司;Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermofisher有限公司;差示掃描量熱儀 美國(guó)TA有限公司;D2 PHASER X射線衍射儀 布魯克公司;DF-101S數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 上海易友儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 明膠/殼聚糖靜電紡絲共混液的制備 42 ℃下使用80% w/V乙酸溶液制備濃度為7.2% w/V的明膠溶液,首先將明膠粉末溶于乙酸溶液中,在42 ℃條件下磁力攪拌1 h完全溶解,然后分別以明膠∶殼聚糖=6∶1、8∶1、10∶1的比例添加殼聚糖粉末。將該溶液在室溫下磁力攪拌24 h至殼聚糖完全溶解[20]。

1.2.2 靜電紡絲參數(shù) 將靜電紡絲共混液裝進(jìn)5 mL注射器中,使用DP 30靜電紡絲設(shè)備進(jìn)行靜電紡絲,電壓設(shè)置為25 kV,推進(jìn)速度為0.01 mm/h。設(shè)置接收材料為鋁箔紙,紡絲針頭到接收裝置的距離為10 cm,測(cè)試溫度和相對(duì)濕度分別為(25±5) ℃和50%±5%。

1.2.3 分析測(cè)試

1.2.3.1 靜電紡絲共混液流變性能表征 黏度的測(cè)定在Saowakon等試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化[21]。使用流變儀測(cè)定靜電紡絲共混液在靜態(tài)剪切作用下的流變性能,平板直徑為20 mm,測(cè)試溫度控制在(25±5) ℃。

1.2.3.2 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR) 使用Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)不同的抗菌膜進(jìn)行分析,以未經(jīng)處理的明膠粉末和殼聚糖粉末為對(duì)照組,分析參數(shù)為:范圍:4000～500 cm-1,間隔1 cm-1,分辨率為4 cm-1[22]。

1.2.3.3 X射線衍射(XRD) 使用Bruker D8 Advance X射線衍射分析儀對(duì)不同的抗菌膜進(jìn)行物相分析。以未經(jīng)處理的明膠粉末和殼聚糖粉末為對(duì)照組,參數(shù)設(shè)置為:電壓為20 kV,電流5 mA,Kα(λ=1.5418 ?),掃描速率4 °/min,步長(zhǎng)0.02°,掃描范圍5°～40°[23]。

1.2.3.4 熱力學(xué)分析 采用TGA Q50(美國(guó)TA)熱重分析儀測(cè)定不同樣品的TGA參數(shù)。以未經(jīng)處理的明膠粉末和殼聚糖粉末為對(duì)照組,參數(shù)設(shè)置為:10 mg樣品以10 ℃·min-1的加熱速率升溫到600 ℃,采用TA-Universal Analysis軟件分析結(jié)果。

采用差示掃描量熱儀(美國(guó)TA)測(cè)定不同樣品的DSC參數(shù),以未經(jīng)處理的明膠粉末和殼聚糖粉末為對(duì)照組,參數(shù)設(shè)置為:10 mg樣品放入有蓋的鋁樣品架中在氮?dú)鈿夥障乱?0 ℃·min-1的加熱速率升溫到250 ℃[24]。

1.2.3.5 掃描電鏡觀察靜電紡絲纖維膜的狀態(tài) 采用掃描電鏡觀察靜電紡絲納米纖維的形貌結(jié)構(gòu),其中放大倍數(shù)10K倍,加速電壓5 kV,工作距離10 mm,并采用Image J對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.3.6 抗菌活性 平板抑菌試驗(yàn):用裁紙刀分別裁取1 cm2的3種不同配比的靜電紡絲抗菌膜,在紫外燈下照射1 h殺菌備用。將接種量為1%的四種菌分別涂布BHI培養(yǎng)基,用無(wú)菌鑷子夾取四種纖維膜放到培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h測(cè)量抑菌圈直徑大小。

掃描電鏡觀察菌體表面結(jié)構(gòu):取對(duì)數(shù)期菌液1 mL以6000 r/min離心10 min,去上清用0.85% NaCl 洗滌3次,加入1 mL滅菌的生理鹽水,每種菌液中分別加入50 mg靜電紡絲膜,以不加入抗菌膜的菌液為空白對(duì)照組,振蕩混勻,室溫下處理6 h。取處理好的菌液置于掃描電子顯微鏡下觀察菌體表面形態(tài)的變化,其中放大倍數(shù)5K倍,加速電壓5 kV,工作距離10 mm[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)重復(fù)3次,同一批樣品指標(biāo)均測(cè)定三次,測(cè)定結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 17.0軟件、Image J軟件和STATISTIX 8進(jìn)行數(shù)據(jù)和制圖分析,使用origin 8.5軟件作圖,顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜電紡絲共混液流變性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

溶液的黏度對(duì)靜電紡絲纖維的尺寸和形態(tài)都有重要的影響。過(guò)低的黏度不能形成纖維,而過(guò)高的黏度會(huì)導(dǎo)致共混液無(wú)法噴出。因此靜電紡絲共混液的黏度對(duì)紡絲效果的好壞起決定性的作用[26]。從圖2可以看出,明膠殼聚糖共混液的黏度隨著剪切速率的增加逐漸降低,隨著殼聚糖含量的增加,黏度呈現(xiàn)增加趨勢(shì),這可能是因?yàn)闅ぞ厶呛康纳呤构不煲褐芯酆衔锏暮吭黾?殼聚糖明膠配比為6∶1時(shí)黏度最高。

圖2 不同配比靜電紡絲共混液流變圖

2.2 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)測(cè)定結(jié)果

衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)是快速有效識(shí)別有機(jī)化合物官能團(tuán)的方法[1]。本試驗(yàn)通過(guò)分析明膠/殼聚糖納米抗菌膜的ATR-FTIR觀察其復(fù)合材料的組分構(gòu)成。結(jié)果見(jiàn)圖3,由圖3可知,3290～3350 cm-1處的吸收峰屬于N-H的伸縮振動(dòng)峰;2800 cm-1處的吸收峰是甲基的伸縮振動(dòng)峰[26]。1650 cm-1的吸收峰為酰胺I帶伸縮振動(dòng)峰,1550 cm-1處的吸收峰為酰胺II帶的伸縮振動(dòng)峰,1250 cm-1處的吸收峰為酰胺Ⅲ帶的伸縮振動(dòng)峰,以上這些吸收峰都是明膠和殼聚糖的特征峰。1020 cm-1處的吸收峰是殼聚糖分子中C-O-C對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮導(dǎo)致的[27]。納米纖維膜在1700 cm-1顯示出了一個(gè)很強(qiáng)的譜帶,可能是明膠和殼聚糖之間通過(guò)氫鍵發(fā)生了相互作用[20]。復(fù)合材料的吸收峰較殼聚糖和明膠相比吸收峰的位置基本一致,說(shuō)明靜電紡絲后并沒(méi)有新的物質(zhì)產(chǎn)生。

圖3 靜電紡絲材料FT-IR圖

2.3 X射線衍射結(jié)果

如圖4所示,研究了殼聚糖粉末、明膠粉末和不同配比明膠殼聚糖納米纖維的晶體結(jié)構(gòu)。由圖可知,殼聚糖粉末在2θ=19.8°處有個(gè)窄的衍射峰。明膠粉末在2θ=21°處有個(gè)寬峰。而6∶1、8∶1、10∶1的納米抗菌膜在2θ=16°、30°、41°有不明顯的寬峰。6∶1、8∶1的寬峰幾乎重合,而10∶1的納米纖維在2 θ=21°處的寬峰明顯高于6∶1、8∶1的,這是蛋白質(zhì)的無(wú)序性及酸對(duì)其結(jié)構(gòu)的降解作用導(dǎo)致的,因此,納米纖維都沒(méi)有顯示出他們的特征衍射峰。這可能是電紡過(guò)程降低高分子的結(jié)晶性,促進(jìn)高分子無(wú)序結(jié)構(gòu)的形成[28]。X衍射圖沒(méi)有顯示出納米纖維峰之間的明顯差異,乙酸中的H+能與殼聚糖發(fā)生反應(yīng)使其水解,破壞殼聚糖的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致結(jié)晶度降低。這在靜電紡絲過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用[29-30]。

圖4 不同靜電紡絲材料XRD圖

2.4 熱力學(xué)分析結(jié)果

圖5顯示了殼聚糖、明膠和不同配比納米抗菌膜的熱力學(xué)分析曲線。

TGA結(jié)果如圖5A所示,單一粉末和納米纖維膜的分解主要分為兩步。在100～150 ℃有個(gè)溫度的下降,這是物質(zhì)的水分流失造成的。280～400 ℃出現(xiàn)一個(gè)大幅下降,主要是因?yàn)榧{米纖維膜中殼聚糖的分解[31]。從圖5A中可以看出,由于生物聚合物單體內(nèi)部共價(jià)鍵的降解,失重的情況隨著殼聚糖含量的降低出現(xiàn)梯度上升[32],在600 ℃時(shí),6∶1、8∶1組的殘留量明顯高于10∶1組,且高于明膠和殼聚糖粉末,這是因?yàn)殪o電處理后的殼聚糖和明膠材料的穩(wěn)定性和耐熱性顯著上升。

由圖5B可知,所有的納米膜都有相似的吸熱峰，在100～130 ℃有一個(gè)明顯的吸收峰，與TGA顯示了相同的結(jié)果。明膠粉末在70和95 ℃范圍內(nèi)有一些小的吸收峰,推測(cè)因?yàn)槊髂z粉末是一種混合[33],納米纖維膜在220 ℃左右呈現(xiàn)了一個(gè)小的吸收峰,且6∶1的納米纖維的轉(zhuǎn)變溫度高于8∶1組和10∶1組,這是因?yàn)檫@個(gè)峰的與纖維膜中氨基的分解有關(guān),而6∶1組的殼聚糖含量高于8∶1和10∶1組,胺基含量高于另外兩組。納米纖維的轉(zhuǎn)變溫度高于殼聚糖和明膠粉末,表明納米膜中殼聚糖和明膠之間的物理鍵使其耐熱性增加。這與Tsai等[34]的研究結(jié)果一致,表明靜電紡絲工藝可以增加分子間的相互作用,提高復(fù)合抗菌膜的熱穩(wěn)定性。

圖5 不同靜電紡絲材料熱力學(xué)分析圖

2.5 納米抗菌膜掃描電鏡結(jié)果

圖6為不同配比明膠/殼聚糖抗菌膜的SEM照片及纖維直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果。不同配比的明膠/殼聚糖抗菌膜呈現(xiàn)不同的纖維狀態(tài)。隨著殼聚糖濃度的升高,納米纖維逐漸呈現(xiàn)出均勻無(wú)序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。明膠∶殼聚糖=6∶1時(shí)的抗菌膜連續(xù)性好,無(wú)斷絲現(xiàn)象且不存在明顯結(jié)節(jié),直徑主要在60～80 nm范圍內(nèi)。明膠∶殼聚糖=8∶1時(shí)納米纖維有部分?jǐn)嗔训那闆r出現(xiàn),直徑比6∶1組減小,主要分布在40～60 nm范圍內(nèi),且有少量纖維開(kāi)始彎曲;明膠∶殼聚糖=10∶1時(shí)的SEM結(jié)果顯示,纖維已經(jīng)出現(xiàn)大面積的斷裂和彎折狀態(tài),伴隨著纖維粗細(xì)不均的情況。結(jié)合共混液的黏度分析,可能是因?yàn)闅ぞ厶呛康纳呤构不煲吼ざ仍龃?使明膠和殼聚糖之間的交聯(lián)達(dá)到更加穩(wěn)定的狀態(tài)[35]。

圖6 不同配比明膠/殼聚糖抗菌膜的SEM照片及纖維直徑分布圖

2.6 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果 用不同配比的靜電紡絲抗菌膜進(jìn)行平板抑菌實(shí)驗(yàn),分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選出的大腸桿菌、克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、沙門(mén)氏菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果圖7所示,由圖中可以看出,不同配比的靜電紡絲抗菌膜對(duì)不同的致病菌都有較強(qiáng)的抑制作用,抗菌膜覆蓋的地方無(wú)致病菌生長(zhǎng)。

圖7 不同配比靜電紡絲抗菌膜平板抑菌圖

2.6.2 掃描電鏡觀察結(jié)果 圖8表示SEM觀察四種致病菌的菌體形態(tài),四種致病菌的對(duì)照組菌體細(xì)胞完整,表面光滑,呈規(guī)則的短桿狀,細(xì)胞間隙明顯,均呈現(xiàn)單層排列,菌體之間無(wú)連接,呈現(xiàn)大小均一的圓桿狀。10∶1抗菌膜處理的大腸桿菌呈現(xiàn)單層結(jié)構(gòu),但是菌體稍松散;克雷伯氏菌出現(xiàn)輕度的菌體皺縮和粘連狀態(tài),肺炎克雷伯氏菌菌體變短彎曲,且出現(xiàn)部分粘連,沙門(mén)氏菌的菌體有輕微內(nèi)容物溶出的狀況。8∶1抗菌膜處理的大腸桿菌開(kāi)始皺縮,內(nèi)容物溶出,菌體開(kāi)始粘連,部分菌體已完全粘在一起;克雷伯氏菌的菌體粘連比10∶1處理組更嚴(yán)重,菌體較松散且呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則排布,有輕微聚團(tuán)現(xiàn)象。肺炎克雷伯氏菌已出現(xiàn)明顯的菌體變短萎縮,大面積粘連的現(xiàn)象。沙門(mén)氏菌的菌體部分細(xì)胞壁缺失,出現(xiàn)明顯的菌體堆積。6∶1抗菌膜處理的大腸桿菌出現(xiàn)嚴(yán)重粘連現(xiàn)象,克雷伯氏菌的菌體皺縮粘連在一起,肺炎克雷伯氏菌細(xì)菌細(xì)胞嚴(yán)重變形,呈不規(guī)則球形,沙門(mén)氏菌能看到明顯的內(nèi)容物溶出,菌體連成片,說(shuō)明抗菌膜處理對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜造成嚴(yán)重破壞,6∶1抗菌膜處理組菌體損傷最嚴(yán)重。

圖8 不同配比靜電紡絲抗菌膜抑菌效果SEM圖(放大倍數(shù)5 K倍)

抑菌實(shí)驗(yàn)表明不同配比的明膠/殼聚糖納米抗菌膜均具有抑菌效果,以明膠/殼聚糖=6∶1實(shí)驗(yàn)組的抑菌效果最明顯,說(shuō)明主要是抗菌膜中的殼聚糖激活了微生物的幾丁質(zhì)酶的活性,導(dǎo)致其自身細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的降解,從而損傷細(xì)菌的細(xì)胞壁[36]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備了不同配比的明膠/殼聚糖納米纖維抗菌膜,并對(duì)抗菌膜進(jìn)行熱力學(xué)表征、定性定量分析和抗菌研究,結(jié)果表明:不同配比的明膠/殼聚糖納米抗菌膜并沒(méi)有發(fā)生化學(xué)鍵之間的改變,明膠∶殼聚糖=6∶1靜電紡絲納米抗菌膜失重最少,具有較好的熱力學(xué)性能。根據(jù)抑菌試驗(yàn)得出:不同配比的明膠/殼聚糖靜電紡絲納米抗菌膜均具有抑菌效果,以明膠∶殼聚糖=6∶1組的抑菌效果最顯著,試驗(yàn)結(jié)果表明,明膠/殼聚糖=6∶1時(shí)抗菌膜的綜合性能最好,在有效抑菌的同時(shí)具有優(yōu)秀的熱力學(xué)性能,可以在本試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上添加植物精油等提高抗菌性能、改善吸水性能、為可食用抗菌包裝材料的制作提供更多的可能。