超聲輔助提取福橘果皮類胡蘿卜素的工藝優(yōu)化

倪玉潔,馬文霞,謝 倩,葉清華,何淑敏,張靜芳,董 浩,陳清西

(福建農(nóng)林大學園藝學院,福建福州 350002)

福橘(CitrusreticulataBlanco.cv Fuju)別名紅橘、漳州橘,為蕓香科柑橘屬植物。福橘原產(chǎn)于福州,在福建地區(qū)已經(jīng)種植了1000多年,并在1985年被正式確定為福州市市果[1-2]。福橘屬寬皮柑橘,果皮寬松易剝,顏色艷麗,呈橙紅色或鮮橙紅色[3]。大部分果實用于鮮食或貯藏后食用,果皮則被丟棄。實際上,福橘果皮占全果總重量的20%左右,目前,還未見有對福橘果皮深加工和利用的研究和報道。加工產(chǎn)品少,副產(chǎn)品利用率不高,是福橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大缺陷[4]。所以,增強果皮的綜合利用,提高福橘產(chǎn)品的附加價值,增升福橘產(chǎn)業(yè)的包容性,實現(xiàn)加工轉(zhuǎn)化增值,對福橘資源的整合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關重要。

柑橘果皮積累了大量的類胡蘿卜素,作為一種天然色素,可用于制成食品營養(yǎng)強化劑和著色劑[5-7]。目前,類胡蘿卜素提取方法主要有溶劑提取、酶輔助提取、微波輔助提取、超聲輔助提取、超臨界流體萃取等[8]。超聲輔助提取利用超聲過程中產(chǎn)生的空化作用和熱效應,使植物細胞壁破裂,加快目標物質(zhì)溶出[9-10]。類胡蘿卜素是脂溶性化合物,組成成分復雜,一般選用極性大小不同的混合有機溶劑進行提取,其中丙酮、己烷和乙醇的混合液最常用來同時提取極性和非極性類胡蘿卜素[11-12]。Barba等[13]在對新鮮蔬菜水果類胡蘿卜素進行測定之后,建議使用正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1對類胡蘿卜素進行提取;Lee等[14]將正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1作為提取劑對橙汁中的類胡蘿卜素進行提取并進行定性和定量分析。目前,超聲波輔助有機溶劑提取法在提取有機酸[15]、多糖[16]、總黃酮[17]、酚[18-19]等方面已被廣泛使用。

因此,本試驗以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,BHT)為提取劑,考察不同條件對類胡蘿卜素提取的影響,以單因素試驗結(jié)果為基礎,結(jié)合響應面試驗結(jié)果,優(yōu)化超聲法提取類胡蘿卜素的最佳條件,以期為福橘果皮的深度開發(fā)與資源整合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福橘果實 2019年1月4日采于福建省福州市連江縣曉澳鎮(zhèn)道澳村英貴家庭農(nóng)場,采后洗凈,取果皮有色層凍于液氮,存于-80 ℃冰箱;丙酮、無水乙醇、正己烷、BHT 均購于上海滬試試驗室器材股份有限公司,為分析純。

KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司);UV WinLab V6紫外可見分光光度計 美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 類胡蘿卜素的提取 精確稱取研磨后的鮮樣粉末0.0800 g,置于10 mL離心管中,按一定液料比加入正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液,混勻后在一定的超聲時間、溫度和超聲功率下進行提取。冷卻后于室溫12000 r/min下離心10 min,取上清液。按照上述步驟重復提取,合并上清液,取出1 mL以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液進行定容,此為待測液。類胡蘿卜素在光照條件下易分解或異構(gòu)化,試驗全程在避光條件下進行。

1.2.2 單因素實驗 以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)溶液為提取劑,參照郭琳琳[20]的方法,設定單因素初始條件液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率以及提取次數(shù)分別為60∶1 (mL/g)、20 min、30 ℃、240 W和1次。

考察液料比對提取量的影響時,按照20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g的液料比加入提取劑,其余條件同1.2.1。

考察超聲時間對提取量的影響時,以液料比60∶1 (mL/g)加入提取劑,超聲時間設置為0、5、10、20、30、40 min,其余條件同1.2.1。

考察超聲溫度對提取量的影響時,固定液料比和超聲時間分別為60∶1 (mL/g)和10 min。將超聲溫度設置為30、35、40、45、50、55 ℃,其余條件同1.2.1。

考察超聲功率對提取量的影響時,按液料比60∶1 (mL/g)加入提取劑、設定超聲時間和溫度分別為10 min和50 ℃,設置超聲功率為150、180、210、240、270 W,其余條件同1.2.1。

考察提取提取次數(shù)對提取量的影響時,按液料比、超聲時間、溫度和功率分別為60∶1 (mL/g)、10 min、50 ℃和240 W進行試驗,分別提取1、2、3、4、5次。

1.2.3 響應面設計試驗 以單因素試驗結(jié)果為根據(jù),同時結(jié)合實際操作,選擇對類胡蘿卜素提取量大的影響因素和水平進行3因素3水平的響應面試驗。固定超聲時間和提取次數(shù)分別為10 min和2次。以超聲功率(A)、超聲溫度(B)和液料比(C)為自變量,以果皮類胡蘿卜素提取量為響應值,使用Design Expert 8.0軟件,根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理設計試驗,試驗設計因素水平見表1。

表1 各因素水平編碼

1.2.4 類胡蘿卜素的測定 參照馬少君等[21]的方法選用450 nm為檢測波長,以提取劑為空白對照。根據(jù)Beer-Lambert定律對類胡蘿卜素提取量進行計算[22-23],公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)分析

以Excel 2003整理數(shù)據(jù),以SPSS 19.0進行顯著性分析,用Origin 17.0和Design Expert 8.0進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對類胡蘿卜素提取的影響 由圖1可知,類胡蘿卜素提取量隨溶劑用量的增多先上升后下降,隨后穩(wěn)定下來,在液料比60∶1 (mL/g)時達到最高值。這可能是由于溶劑增多,加上超聲作用,樣品和提取劑得到了充分接觸,使得類胡蘿卜素充分溶出,但提取劑過量,將削弱超聲對細胞壁的破碎作用,影響目標物質(zhì)的溶出,降低提取效率[24-25]。

圖1 液料比對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.2 超聲時間對類胡蘿卜素提取的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的延長,類胡蘿卜素提取量在超聲10 min時達到最大值,此后緩慢下降,當超聲時間>20 min時,提取量顯著下降(P<0.05)。類胡蘿卜素易受溫度、氧氣的影響發(fā)生降解,可能是由于超聲作用一方面加快了類胡蘿卜素的溶出速率,一方面提取時間過長,類胡蘿卜素受氧化作用而降解[26]。

圖2 超聲時間對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.3 超聲溫度對類胡蘿卜素提取的影響 由圖3可知,隨著超聲溫度的升高,類胡蘿卜素提取量不斷升高,在50 ℃時達到最高值0.528 mg/g,繼續(xù)升高溫度提取量顯著下降(P<0.05)。這可能是由于溫度過高,受高溫作用影響,類胡蘿卜素發(fā)生了降解[27]。

圖3 超聲溫度對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.4 超聲功率對類胡蘿卜素提取的影響 由圖4可知,隨著超聲功率的增加,類胡蘿卜素提取量持續(xù)升高,當超聲功率達到240 W時,提取量達到最高值隨后又顯著下降(P<0.05)。這可能是由于超聲作用加速了細胞壁的破碎,從而增強了類胡蘿卜素的溶出,當超聲作用增大到空間效應飽和時,繼續(xù)加強超聲功率會加強超聲波的散射和衰弱,不利于類胡蘿卜素的提取[28]。

圖4 超聲波功率對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.5 提取次數(shù)對類胡蘿卜素提取的影響 由圖5可知,提取次數(shù)越多類胡蘿卜素的提取效果越好,但在第2次提取之后,提取量趨于穩(wěn)定,且之后提取量之間沒有顯著性差異(P>0.05)。說明經(jīng)過兩次提取,可基本將樣品中的類胡蘿卜素提取出來。再增加提取次數(shù)對類胡蘿卜素的提取量影響不大。因此,為簡化試驗步驟,將提取次數(shù)設置為2次。類胡蘿卜素長期暴露在空氣中,易被氧化分解。因此,為保證重復實驗的穩(wěn)定性和一致性,利用響應面法優(yōu)化提取工藝時將提取次數(shù)固定為2次,不作為優(yōu)化因素。

圖5 提取次數(shù)對類胡蘿卜素提取的影響

2.2 類胡蘿卜素提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果 在單因素實驗基礎上,運用Box-Behnken中心組合原理設計試驗,試驗設計與結(jié)果見表2。通過Design Expert 8.0分析試驗結(jié)果,得到回歸方程:Y=0.75-0.020A+0.019B-0.016C+0.017AB+0.0036AC+0.0033BC-0.083A2-0.092B2-0.17C2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

表3 響應面二次回歸模型方差分析

2.2.2 響應面分析 在回歸模型中,將其中一個因素固定在0水平,代入方程考察另外兩個因素之間的相互作用。根據(jù)響應面試驗結(jié)果,運用Design Expert 8.0軟件做出響應面圖和等高線圖(圖6)。圖6中可以看出,三個響應面圖坡面均較為平緩,等高線圖均呈現(xiàn)橢圓形,表明類胡蘿卜素提取量受兩兩因素交互作用影響小。但任意兩個因素的交互作用都存在一個最高點,說明通過改變液料比、提取溫度和功率三個因素,可以使類胡蘿卜素的提取效果達到最佳。

圖6 各因素交互作用響應面和等高線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝及驗證試驗 通過Design Expert 8.0軟件對福橘果皮類胡蘿卜素提取回歸方程進行優(yōu)化分析,預測在液料比59.04∶1 (mL/g),超聲溫度50.47 ℃,超聲功率236.65 W條件下,類胡蘿卜素的提取量理論值為0.756 mg/g。為方便操作,將最佳條件調(diào)整為液料比、超聲功率和超聲溫度分別為59∶1 (mL/g),240 W和50 ℃。在該條件下重復2次,得到類胡蘿卜素提取量的平均值達到(0.747±0.027) mg/g,與預測值基本一致。因此,該模型具有一定的可信度,通過響應面試驗可以優(yōu)化超聲法對福橘果皮類胡蘿卜素提取工藝條件。

3 討論與結(jié)論

柑橘外果皮包括有色層和白皮層兩部分,其主要呈色物質(zhì)—類胡蘿卜素主要儲存在有色層之中[29]。曾東慧等[30]以溫州蜜柑為材料,測得其果皮類胡蘿卜素含量達到0.351 mg/g;邵金華等[31]測得柚皮中含有類胡蘿卜素0.306 mg/g。而本試驗結(jié)果顯示福橘果皮有色層類胡蘿卜素含量高達到(0.747±0.027) mg/g,足見福橘果皮中也積累了豐富的類胡蘿卜素。

在應用超聲輔助提取類胡蘿卜素的過程中,提取量會隨著提取因素的變化而變化,且試驗對象不同,其提取工藝也有所差異。如提取劑的種類和極性影響目標物質(zhì)的溶出速率,超聲溫度對溶質(zhì)的溶解效果產(chǎn)生直接作用,超聲功率對溶劑穿透力和溶質(zhì)溶出速度有重要影響,而液料比、超聲時間和提取次數(shù)通過影響物料和溶劑的接觸來影響提取量[21]。在運用這一方法提取類胡蘿卜素方面,米雪等[32]認為按液料比40∶1 (mL/g)加入無水乙醇,在超聲功率和溫度分別為100 W和60 ℃條件下提取30 min時,對柿皮中類胡蘿卜素的提取效果最好;李憲鈔等[33]以丙酮為提取劑,得到玉米苞葉中的類胡蘿卜素最佳提取工藝:液料比、超聲溫度和時間分別為17∶1 (mL/g)、33 ℃、48 min;劉長付等[34]以西紅柿為試材,得到最優(yōu)的類胡蘿卜素提取工藝是以液料比30∶1 (mL/g)加入丙酮∶石油醚=3∶2混合液,在超聲功率和溫度為450 W、24 ℃條件下提取2次,每次25 min。因此,面對不同的提取材料,需要選擇相應的提取工藝才能達到最佳的提取效果。

目前,在柑橘類胡蘿卜素的提取上,多采用有機溶劑提取、酶輔助提取、微波輔助提取和超聲輔助提取。胡建中[35]采用有溶劑提取提取橘皮中的類胡蘿卜素,得出在溫度40 ℃,提取時間2 h,固液比1∶20 mL/g條件下提取2次得到的提取效果最佳;廖春燕等[36]用微波法提取橘皮中的類胡蘿卜素,最后得出以石油醚為提取劑浸提30 min后,在固液比1∶20 mL/g,微波功率560 W條件下提取2次,每次60 s的效果最好;Cinar[37]利用纖維素酶和果膠酶組合法提取橙皮中的類胡蘿卜素,得到在纖維素酶和果膠酶分別為0.1 g/100 g和5 mL/100 g組合條件下,效果最好。本試驗以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)為提取劑,采用超聲輔助提取福橘果皮中的總類胡蘿卜素。以單因素實驗結(jié)果為依托選擇響應面試驗因素和水平,以Box-Behnken試驗設計原理設計試驗,進行響應面分析。最后確定最佳提取工藝為液料比59∶1 (mL/g)、超聲功率240 W和溫度50 ℃,提取時間和次數(shù)分別為10 min和2次。與前人研究中的有機溶劑提取、酶輔助提取和微波輔助提取法相比,該方法耗時少成本低,操作簡便。運用該方法得到福橘果皮中類胡蘿卜素的提取量最大可達到(0.747±0.027) mg/g,與預測值基本一致。說明福橘果皮中積累了豐富的類胡蘿卜素,利用超聲輔助提取福橘果皮類胡蘿卜素能達到良好效果,也為福橘果皮的綜合利用和深入開發(fā)提供了指導。