藍(lán)刺頭多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

史曉宇,高珍珍,張 超,楊 英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

藍(lán)刺頭(EchinopslatifoliusTausch,ET)為菊科藍(lán)刺頭屬植物,主要分布在中國、蒙古、西伯利亞等地區(qū)。根和花序皆可入藥,干燥根為中藥“禹州漏蘆”,可清熱解毒、舒筋通脈、消癰、下乳;干燥花序為蒙藥“藍(lán)刺頭”,蒙古語名“扎日阿-烏拉”,可愈傷、固骨質(zhì)、清熱止痛[1]。研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)刺頭中含有生物堿、噻吩類、揮發(fā)油類、黃酮類等多種化合物,具有保肝、抗炎、殺蟲、抗腫瘤等多種藥理活性[2],具有良好應(yīng)用開發(fā)前景。藍(lán)刺頭多糖(EchinopslatifoliusTausch polysaccharide,ETP)為藍(lán)刺頭所含有的高分子化合物。研究表明,具有多種生物活性,如降血糖、抗氧化、改善脂代謝[3-5]等,可作為功能性食品的潛在原料。

大量研究表明,機體衰老、慢性疾病及癌癥均與自由基有密切關(guān)系[6],自由基參與的氧化反應(yīng)會損傷核酸、碳水化合物、脂類及蛋白質(zhì),從而對機體產(chǎn)生影響[7-8]。自由基具有極強的氧化反應(yīng)能力[9],能通過氧化作用來攻擊機體內(nèi)的大分子物質(zhì),產(chǎn)生過氧化反應(yīng),對機體造成不可逆損傷[10-12]。因此多糖的清除自由基能力常作為評價其抗氧化活性的重要指標(biāo)[13]。相關(guān)研究表明,藍(lán)刺頭粗多糖具有較強還原能力及一定的清除有機自由基能力[14]。多糖的提取方法眾多,其中溶劑提取法簡單、成本低、應(yīng)用最為廣泛[15],但對于提取工藝研究,目前主要集中在藍(lán)刺頭總黃酮的提取,多糖未有系統(tǒng)的提取條件研究。因此,本研究選用溶劑提取法,通過響應(yīng)面實驗篩選出最佳提取條件。

本實驗選取干燥的藍(lán)刺頭花序為原料,通過響應(yīng)面法對藍(lán)刺頭多糖提取工藝進行優(yōu)化,旨在提高多糖得率,為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考;對藍(lán)刺頭多糖抗氧化活性進行初步探究,為開發(fā)與利用藍(lán)刺頭多糖類食品奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)刺頭 采自內(nèi)蒙古呼和浩特市,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)教研室鑒定;無水乙醇、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、冰乙酸、抗壞血酸(VC) 均為分析純;抗超氧陰離子試劑盒、羥自由基測試盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海麥克林生化科技有限公司。

CU-600型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;CP213電子天平 奧豪斯儀器有限公司;熱電冷凍干燥機 美國Thermo Fisher Scientific;全功能酶標(biāo)儀 美國Synergy H4 Hybrid。

1.2 實驗方法

1.2.1 ETP的提取 將采摘后的藍(lán)刺頭花序放于60 ℃烘干至恒重,采用水提醇沉法提取藍(lán)刺頭多糖。步驟為在一定溫度和時間下水提,三層紗布對水提液進行過濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮(溫度55 ℃,轉(zhuǎn)速50 r/min),用95%乙醇進行醇沉,靜置過夜,棄掉上清液,真空冷凍干燥,收集,稱重。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg,加蒸餾水溶解并定容至100 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分別置于50 mL容量瓶中,加蒸餾水定容。精密量取上述各溶液80 μL置96孔微量反應(yīng)板中,分別加5%苯酚溶液40 μL,迅速滴加濃硫酸200 μL,吹打搖勻,冷卻至室溫后,用酶標(biāo)儀測定490 nm處的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x,%)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如,得回歸方程為y=9.6115x+0.1204(R2=0.9937)。精密稱取藍(lán)刺頭多糖10 mg,加蒸餾水10 mL溶解成1 mg/mL,取80 μL置96孔微量反應(yīng)板中,加5%苯酚溶液40 μL,迅速滴加濃硫酸200 μL,吹打搖勻,冷卻至室溫后,用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度y值,將平均y值代入回歸方程,計算樣品多糖含量。

多糖得率計算公式為:

多糖得率(%)=粗多糖質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)×100

1.2.3 單因素實驗 采用水提醇沉法提取藍(lán)刺頭多糖,測定多糖得率。選取料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)、提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3、4次)、醇沉濃度(70%、75%、80%、85%、90%)做單因素試驗,對藍(lán)刺頭多糖提取工藝進行優(yōu)化,其中固定因素水平為料液比1∶25 g/mL、提取時間2.0 h、提取溫度80 ℃、提取次數(shù)2次、醇沉濃度80%。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇影響較顯著的三個因素料液比、提取溫度和提取時間為自變量,以多糖得率為響應(yīng)值,使用響應(yīng)面軟件 Design-Expert8.0.6.1中Box-Behnken的設(shè)計方法,進行三因素三水平試驗設(shè)計,優(yōu)化藍(lán)刺頭多糖提取工藝。各組試驗的編碼水平與取值見表1。當(dāng)P<0.05,該模型和回歸系數(shù)被認(rèn)為差異性顯著。

表1 響應(yīng)面分析因素水平

1.2.5.1 ETP對二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)清除能力的測定 通過酶標(biāo)儀在517 nm波長處檢測吸光度值,計算樣品清除DPPH·自由基的能力。取0.001953～0.125 mg/mL多糖溶液100和100 μL DPPH溶液加入96孔微量反應(yīng)板,于室溫避光反應(yīng)30 min。相應(yīng)濃度的抗壞血酸(VC)作為陽性對照,蒸餾水代替多糖溶液的反應(yīng)體系為空白,并設(shè)置本底對照,使用酶標(biāo)儀檢測517 nm波長處的吸光值,根據(jù)公式(1)計算ETP對DPPH·的清除率。(A0為空白吸光值,Ax為樣品吸光值,Am為本底對照吸光值。)

清除率(%)=[A0-(Ax-Am)]/A0×100

式(1)

1.2.5.2 ETP對羥自由基(·OH)清除能力的測定 根據(jù)試劑盒說明書操作,取0.0625～1.0 mg/mL多糖溶液100和300 μL反應(yīng)體系于37 ℃反應(yīng)1 min,迅速加入1000 μL顯色劑,室溫放置20 min,取200 μL加入96孔微量反應(yīng)板。相應(yīng)濃度的抗壞血酸(VC)作為陽性對照,蒸餾水代替多糖溶液的反應(yīng)體系為空白,并設(shè)置本底對照,使用酶標(biāo)儀檢測550 nm波長處的吸光值,根據(jù)公式(1)計算ETP對·OH的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 料液比對多糖得率的影響見圖1。由圖1可知,在料液比為1∶20時,得率達到頂峰0.86%,隨后下降?？赡艿脑蚴橇弦罕容^小時,短時間內(nèi)多糖的溶出達到平衡,不利于多糖進一步溶出;而料液比太大時,受溶解度的約束作用變小,且溶劑用量過多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難,使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢[16-17]。該因素對多糖得率影響顯著(P<0.05),且料液比為1∶20時提取效果最好,故選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25做后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖1 料液比對多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 提取時間對多糖得率的影響見圖2。由圖2可知,隨著提取時間增加,多糖得率有所上升,在提取時間為2 h時達到頂峰0.78%,隨后有所下降?？赡艿脑蚴浅跗诙嗵窃谌軇┲械臐舛鹊?主要成分在藍(lán)刺頭組織中,內(nèi)外濃度梯度大,導(dǎo)致多糖溶出的速率較快;隨著時間增加,多糖濃度梯度持續(xù)減小,從而使得溶出率減緩至不再增加[18];也可能是由于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等其他大分子穿透細(xì)胞膜,對多糖的溶出產(chǎn)生阻力[19]。該因素對多糖得率影響顯著(P<0.05),且提取時間為2 h時提取效果最好,故選擇提取時間2.0、2.5、3.0 h做后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖2 提取時間對多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響 提取溫度對多糖得率的影響見圖3。由圖3可知,隨著提取溫度上升,多糖得率有所上升,在提取溫度為90 ℃時達到頂峰0.82%,隨后趨于平緩?？赡艿脑蚴沁^高的溫度對多糖的提取影響不明顯[20]。一定范圍內(nèi)，該因素對多糖得率影響顯著(P<0.05),且提取溫度為90 ℃時提取效果最好,故選擇提取溫度80、90、100 ℃做后續(xù)響應(yīng)面試驗。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響 提取次數(shù)對多糖得率的影響見圖4。由圖4可知,隨著提取次數(shù)增加,多糖得率有所上升,在提取次數(shù)為4次時達到頂峰1.13%。提取2次與3次差異較小,考慮實際生產(chǎn)效率與成本,后續(xù)響應(yīng)面試驗提取次數(shù)固定為2次。

圖4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

2.1.5 醇沉濃度對多糖得率的影響 醇沉濃度對多糖得率的影響見圖5。由圖5可知,隨著醇沉濃度增加,多糖得率有所上升,在醇沉濃度為80%時達到小高峰0.82%,醇沉濃度為90%時達到頂峰1.06%。但考慮實際生產(chǎn)效率與成本,后續(xù)響應(yīng)面試驗醇沉濃度固定為80%。

圖5 醇沉濃度對多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

方差分析結(jié)果見表3?；貧w模型的P<0.05,說明該模型的可信度水平大于99.50%;失擬項P>0.05,不顯著,說明該模型與實際實驗值擬合良好,回歸方程可近似替代實驗真實點[21]。同時由對多糖得率的回歸系數(shù)檢驗值F的大小可知,在試驗范圍內(nèi),各因素對多糖得率影響的大小順序依次為:X3(提取溫度)>X1(料液比)>X2(提取時間)。

表3 方差分析和顯著性檢驗

該二次回歸模型的決定系數(shù)R2為0.9467,說明試驗結(jié)果和回歸方程有94.67%的擬合;矯正決定系數(shù)AdjR2為0.8781,表示該模型可以解釋87.81%響應(yīng)值的變化;預(yù)測決定系數(shù)PredR2為0.7906,表示該模型預(yù)測值的能力良好;信躁比Adeq Precision為14.4905,表明該模型是可取的,可以應(yīng)用于工藝優(yōu)化[22]。

將數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.6.1 進行3D圖形繪制,做出料液比(X1)、提取時間(X2)以及提取溫度(X3)對多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖,見圖6。曲面圖可以預(yù)測和檢驗變量的響應(yīng)值,確定變量間相互關(guān)系。響應(yīng)面坡度越陡,表示各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著,坡度越緩,表示各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著;等高圖可以反映變量交互效應(yīng)的強弱。等高線越密集,表示二者交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著,等高線越稀疏,表示二者交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著[23]。

圖6 不同交互作用對多糖得率的響應(yīng)面圖

通過響應(yīng)面的陡峭程度可以發(fā)現(xiàn),提取溫度對藍(lán)刺頭多糖得率的影響最大,其次是提取時間和料液比。由圖6A可知,當(dāng)提取溫度一定時,料液比與提取時間的響應(yīng)曲面曲率均變化不大,說明兩者對響應(yīng)值的影響不大。其等高線圖顯示兩因素呈非明顯的橢圓形狀,兩者交互作用不顯著[24]。由圖6B可知,當(dāng)提取時間一定時,料液比使得響應(yīng)面坡面變化較緩,響應(yīng)值受到料液比的影響較小[25],而提取溫度的變化使得坡面曲率變化較大,其對響應(yīng)值的影響較大,料液比與提取時間之間的交互作用不顯著。由圖6C可知,當(dāng)料液比一定時,提取時間的變化對響應(yīng)值的影響較小,而提取溫度的變化對響應(yīng)曲面的坡面曲率影響較大,提取時間與提取溫度之間的交互作用不顯著。

通過軟件分析,料液比為1∶20 g/mL、提取時間為2 h、提取溫度為100 ℃為最佳提取條件,預(yù)測多糖得率為1.19%。

2.3 驗證實驗

在料液比1∶20 g/mL、提取時間2 h、提取溫度100 ℃、提取次數(shù)2次、醇沉濃度80%的條件下進行三次平行驗證實驗,測得多糖得率平均值為1.191%,與理論得率值相近。該值與預(yù)測值相近,表明回歸模型可靠。

2.4 抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 ETP對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的測定 最大半效應(yīng)濃度EC50計算結(jié)果顯示,VC(0.0061 mg/mL)<多糖(0.0259 mg/mL)。從圖7A可以看出,在0.001953～0.125 mg/mL的多糖濃度范圍內(nèi),多糖的清除率由15.91%上升到93.69%。在試驗濃度范圍內(nèi),VC的清除能力高于多糖。

2.4.2 ETP對羥自由基(·OH)清除能力的測定 EC50計算結(jié)果顯示,多糖(0.1207 mg/mL)VC,在濃度為1.0 mg/mL時,VC的清除能力高于多糖。

圖7 ETP對三種自由基的清除作用

3 討論與結(jié)論

本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上,比較各影響因素,分析三個影響效果顯著的因素及影響程度,結(jié)合Box-Behnken分析,建立優(yōu)化水提醇沉法提取藍(lán)刺頭多糖的數(shù)學(xué)模型[26]。研究得出水提醇沉法提取藍(lán)刺頭多糖的最佳工藝條件,為進一步深入研究藍(lán)刺頭多糖提供了參考依據(jù)，該方法在提高得率的同時,有效保護了多糖的抗氧化活性,研究結(jié)果為藍(lán)刺頭多糖作為功能性原料用于食品工業(yè)提供了技術(shù)支持和理論數(shù)據(jù)。