葛根多糖純化工藝及其抗氧化性能研究

朱家慶,唐婷范,劉新梅,田玉紅,黃芳麗,程 昊,李曉慧,李榮彬,梁杰婷

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西柳州 545006)

葛根(Puerarialobata)別名葛藤,葛麻葉,粉葛藤等[1],產(chǎn)自安徽、廣西、湖北、湖南、云南等地[2],葛根具有降血脂、降血糖、降血壓[3],抗氧化自由基[4-5],預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[6-7]。多糖是高分子聚合而成的碳水化合物,具有很好的生物活性及藥理作用[8-11],安全無(wú)毒。董洲等[12]在野葛根中分離純化出新型酸性多糖,鑒定了該多糖的結(jié)構(gòu)特征可用于免疫調(diào)節(jié)活性,也證明了葛根里含有多糖類(lèi)化合物。陳兵兵[13]對(duì)葛根多糖進(jìn)行逐級(jí)分離,通過(guò)體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn),葛根多糖具有較好的等價(jià)抗氧化能力。但原生態(tài)葛根中非多糖類(lèi)物質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,使多糖的利用率隨之下降,葛根多糖作為有益的天然產(chǎn)物不利用起來(lái)又會(huì)導(dǎo)致資源的浪費(fèi),所以對(duì)葛根多糖的分離純化是一個(gè)亟待解決的難題。

近年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖的純化工藝深入研究[14-16],到目前多糖的分離純化方法有很多,Chen等[17]采用ASE技術(shù)快速分離提取多糖,Nie等[18]采用陰離子交換色譜法純化生菜多糖,這些方法操作復(fù)雜,成本高,吸附速度慢,選擇性差,難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。與此同時(shí),大孔樹(shù)脂純化法具有吸附容量大、有效成分損失少、成本低、雜質(zhì)去除率高等優(yōu)點(diǎn),常用于多糖的分離純化。陳琛等[19]利用大孔樹(shù)脂法對(duì)天麻多糖進(jìn)行純化工藝研究,實(shí)驗(yàn)表明大孔樹(shù)脂法是多糖類(lèi)常用的純化方法,且純化效果較好。

本試驗(yàn)以大孔樹(shù)脂法對(duì)葛根多糖進(jìn)行純化研究;在靜態(tài)吸附的基礎(chǔ)上再用層析柱法考查樣液濃度和乙醇解吸的用量對(duì)葛根多糖純化的影響,采用紅外光譜對(duì)純化后的葛根多糖進(jìn)行初步定性分析;再對(duì)葛根多糖溶液清除DPPH·和·OH的能力進(jìn)行試驗(yàn)探討研究[20-21],對(duì)葛根多糖進(jìn)行純化及抗氧化性能初步研究,為葛根的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根干燥塊莖 選用廣西貴港野葛根;葡萄糖、水楊酸 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);苯酚、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、溴化鉀 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;單寧酸 分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng);二苯基苦基肼自由基 分析純,日本W(wǎng)ako公司。

AL104分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;V2000可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SHZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;DHL-B恒流泵 上海青浦瀘西儀器廠(chǎng);RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);INVENIO R紅外光譜儀 布魯克科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根預(yù)處理 葛根塊莖洗凈放入烘箱在60 ℃下烘干,烘干后的葛根充分研磨,然后采用超聲水提法在超聲功率300 W、料液比18 g/mL、提取時(shí)間30 min的條件下提取一次,對(duì)提取液進(jìn)行抽濾,濾液定容到100 mL容量瓶得到粗多糖提取液。

1.2.2 葛根多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[22]測(cè)定葛根多糖純化前后的多糖含量。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 配制濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL具塞試管中,用蒸餾水加至1.0 mL,再移取1.0 mL的5%苯酚溶液加入到試管中,振蕩搖勻后迅速移取5.0 mL的濃硫酸放入試管中,振蕩搖勻靜置反應(yīng)10 min,最后將試管在30 ℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)20 min。用分光光度計(jì)在490 nm處分別測(cè)量其吸光度值然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[23]。

1.2.4 樹(shù)脂吸附和解吸計(jì)算 大孔樹(shù)脂吸附和解吸實(shí)驗(yàn)過(guò)程根據(jù)(1)～(4)公式[24]計(jì)算吸附量、吸附率、解吸量、解吸率。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:Q-樹(shù)脂吸附量(mg/g);E-樹(shù)脂吸附率(%);d-解吸量(mg/g);D-解吸率(%);C0-起始濃度(mg/mL);Ce-平衡濃度(mg/mL);V0-吸附液體積(mL);m-樹(shù)脂質(zhì)量(g);Cd-解吸液濃度(mg/mL);Vd-解吸液體積(mL)。

1.2.5 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理及篩選

1.2.5.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 稱(chēng)取一定量的AB-8、X-5、S-8、H103、NKA-9、ADS-17、HPD-500、DM130、D101型大孔樹(shù)脂分別加入適量的95%乙醇浸泡24 h,讓樹(shù)脂充分溶脹,用無(wú)水乙醇清洗樹(shù)脂數(shù)次,至無(wú)白色渾濁,用蒸餾水將樹(shù)脂洗至無(wú)醇味;將無(wú)醇味的各大孔樹(shù)脂先浸泡在5%的鹽酸溶液,后浸泡在5%的氫氧化鈉溶液各12 h后用水洗為中性,預(yù)處理完的樹(shù)脂浸泡于蒸餾水中備用。

1.2.5.2 大孔樹(shù)脂的篩選 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g已預(yù)處理好的9種大孔吸附樹(shù)脂于250 mL錐形瓶中,在錐形瓶?jī)?nèi)各加入50 mL 0.9651 mg/mL的葛根多糖溶液,振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,進(jìn)行12 h靜態(tài)吸附。依次抽濾吸附平衡液,取出濾液至試管,取出樹(shù)脂至錐形瓶。加入50 mL 60%乙醇,進(jìn)行12 h靜態(tài)解吸。對(duì)靜態(tài)吸附平衡液和解吸液進(jìn)行測(cè)定,篩選出吸附效果和解吸效果最好的大孔樹(shù)脂[24]。

1.2.6 大孔樹(shù)脂靜態(tài)影響因素

1.2.6.1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附平衡時(shí)間 取預(yù)處理過(guò)的D101樹(shù)脂2.0 g,放入250 mL的磨口錐形瓶中,添加50 mL 0.9651 mg/mL的葛根多糖水溶液,進(jìn)行靜態(tài)吸附,設(shè)置振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,讓其充分吸附11 h。每經(jīng)過(guò)1 h用移液管移取一次0.2 mL吸附液,測(cè)定吸附液的吸光度計(jì)算其吸附量,作出吸附量與靜態(tài)吸附時(shí)間的曲線(xiàn)。

1.2.6.2 樹(shù)脂靜態(tài)解吸平衡時(shí)間 將吸附飽和的D101樹(shù)脂進(jìn)行抽濾后放至磨口錐形瓶中,添加50 mL 60%的乙醇進(jìn)行靜態(tài)解吸,設(shè)置振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,充分靜態(tài)解吸樹(shù)脂7 h。每經(jīng)過(guò)1 h取一次0.2 mL解吸液,測(cè)定解吸液的解吸量。

1.2.6.3 樣液濃度對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 將原溶液配制成1.0、0.75、0.5、0.25、0.10 mg/mL濃度的葛根多糖水溶液,進(jìn)行靜態(tài)吸附,振蕩頻率100 r/min,溫度調(diào)為25 ℃,吸附8 h后測(cè)定平衡濃度,計(jì)算吸附量和吸附率。

1.2.6.4 樣液pH對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附的影響 取50 mL 0.5 mg/mL的葛根多糖水溶液5份,分別加入配制好的5%鹽酸和5%氫氧化鈉溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié),調(diào)pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,進(jìn)行靜態(tài)吸附。振蕩頻率100 r/min,溫度25 ℃,充分吸附8 h后測(cè)定平衡濃度,計(jì)算吸附率和吸附量。

1.2.6.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸的影響 取50 mL濃度為0.5 mg/mL的葛根多糖水溶液5份調(diào)節(jié)pH為6.0,振蕩頻率調(diào)為100 r/min,溫度調(diào)為25 ℃,充分吸附8 h后進(jìn)行靜態(tài)吸附;用體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%和80%的乙醇進(jìn)行靜態(tài)解吸3 h,計(jì)算解吸率。

1.2.7 影響樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸的因素 準(zhǔn)確稱(chēng)取已處理好的D101大孔樹(shù)脂20.0 g,使用濕法裝入規(guī)格為(1.5 cm×40cm)層析柱中,柱高度為20cm,進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。

1.2.7.1 上樣液質(zhì)量濃度的影響 利用原溶液配制成0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL濃度的葛根多糖水溶液,在pH為6.0的條件下調(diào)節(jié)上樣速率為1.0 mL/min,各上樣體積為120 mL,動(dòng)態(tài)吸附后測(cè)定多糖流出溶液的吸光度,計(jì)算其吸附率。

1.2.7.2 解吸劑體積對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸的影響 將1.0 mg/mL的葛根多糖水溶液用5%的鹽酸溶液和5%氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)節(jié)為6.0,上樣速度為1.0 mL/min,上樣溶液為120 mL;再用51 mL的60%乙醇進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸,設(shè)置洗脫液流速為1.5 mL/min,每3 mL收集一次解吸出來(lái)的溶液,測(cè)定每支試管溶液中多糖的濃度。

1.2.8 葛根多糖的紅外光譜分析 稱(chēng)取1.0 mg洗脫后干燥的葛根多糖粉末樣品和100 mg KBr混合充分研磨后壓片,使用紅外光譜掃描儀設(shè)置在波長(zhǎng)范圍為4000～400 cm-1[25]內(nèi)掃描,觀(guān)察吸收峰,分析紅外光譜圖。

1.2.9 葛根多糖的抗氧化性能研究 按楊佳琦等[26]、張成等[27]和Yin等[28]的文獻(xiàn)方法稍作修改,分別配制濃度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的葛葉多糖水溶液,以單寧酸作對(duì)照組,測(cè)定純化前和純化后的葛根多糖溶液在510和517 nm處吸光度的變化曲線(xiàn)分析清除·OH和DPPH·的能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各理化指標(biāo)測(cè)定3次,求取平均值減少數(shù)據(jù)誤差。使用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖1可知,標(biāo)準(zhǔn)方程式為:Y=58.905X-0.0911,決定系數(shù)為R2=0.9986,表明在濃度0.002～0.015 mg/mL范圍內(nèi),葡萄糖濃度與吸光值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,適用于葛根多糖含量測(cè)定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 大孔樹(shù)脂的篩選

由表1可知,吸附率:NKA-9>D101>S-8>AB-8>DM130>ADS-17>HPD500>X-5>H103;解吸率:H103>DM130>HPD500>ADS-17>D101>S-8>NKA-9>AB-8>X-5。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)葛根多糖靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果

由于大孔樹(shù)脂的孔徑、極性、比表面積的不同,對(duì)葛根多糖的吸附及解吸的效果也會(huì)存在優(yōu)劣。在上面9種樹(shù)脂中吸附率最高的是NKA-9,但是它的解吸率較低;解吸率最高的樹(shù)脂是H103,而它的吸附率只有55.82%;D101的比表面積和孔徑都在其他樹(shù)脂大小之上,吸附能力和解吸能力也相對(duì)較強(qiáng)。綜合吸附率和解吸率,最優(yōu)的是D101型號(hào)的樹(shù)脂。

2.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸的主要影響因素

2.3.1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附平衡時(shí)間 由圖2可知,大孔樹(shù)脂D101對(duì)葛根多糖靜態(tài)吸附為中速平衡型,0～5 h曲線(xiàn)增長(zhǎng)較快,吸附量變化幅度也很大,5 h以后吸附量逐漸減緩,在8 h后吸附量基本不變,多糖濃度也基本不再改變,大孔樹(shù)脂吸附達(dá)到平衡,所以吸附平衡時(shí)間選擇8 h。

圖2 樹(shù)脂靜態(tài)吸附曲線(xiàn)

2.3.2 樹(shù)脂靜態(tài)解吸平衡時(shí)間 由圖3可知,大孔樹(shù)脂D101對(duì)葛根溶液靜態(tài)解吸呈現(xiàn)快速平衡型增長(zhǎng),0～3 h增長(zhǎng)較快,解吸量變化幅度較大,在3 h以后解吸量基本不變,葛根多糖濃度也基本不再改變,大孔樹(shù)脂解吸達(dá)到平衡,所以解吸平衡時(shí)間選擇3 h。

圖3 樹(shù)脂靜態(tài)解吸曲線(xiàn)

2.3.3 樣液質(zhì)量濃度的影響 由圖4可知,大孔樹(shù)脂D101吸附量隨多糖溶液濃度增加而增加,而吸附率隨著多糖濃度的增大呈現(xiàn)先下降再升高再下降的趨勢(shì)。吸附量最大時(shí)吸附率降低推測(cè)是因?yàn)殡S著多糖濃度的增加,溶液中的雜質(zhì)含量增多,與葛根多糖競(jìng)爭(zhēng)吸附樹(shù)脂位點(diǎn),因此吸附率下降。最終選擇0.75 mg/mL多糖濃度為樣液濃度。

圖4 樣液濃度對(duì)靜態(tài)吸附率和吸附量的影響

2.3.4 樣液pH影響 由圖5可知,大孔樹(shù)脂D101對(duì)多糖吸附量和吸附率隨著pH升高而逐漸增大,且兩者變化趨勢(shì)基本一致,在6.0時(shí)為最大值,即分別為5.6952 mg/g和45.56%,之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì),主要原因是多糖類(lèi)物質(zhì)在酸和堿下易于發(fā)生水解反應(yīng),在微酸性條件下樹(shù)脂活性比較強(qiáng),容易吸附。綜合各方面和變化曲線(xiàn)考慮樣液pH為6.0較適宜。

圖5 樣液pH對(duì)靜態(tài)吸附率和吸附量的影響

2.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 由圖6可知,大孔樹(shù)脂D101對(duì)葛根多糖解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)變大而快速增大,當(dāng)濃度為60%,解吸率為65.13%時(shí),解吸率曲線(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì),而乙醇濃度的增加使大孔樹(shù)脂和葛根多糖之間的作用力削弱,濃度過(guò)大過(guò)小都不利于解析,所以選擇乙醇濃度60%比較適宜。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸率的影響

2.4 影響樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸的因素

圖7 多糖樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

2.4.1 樣液多糖濃度對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響 由圖7可知,大孔樹(shù)脂D101吸附率隨多糖濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在濃度1.0 mg/mL時(shí)吸附率達(dá)到最大57.33%,當(dāng)濃度增大到1.4和1.8 mg/mL時(shí)多糖樣液未能被樹(shù)脂吸附,從而濃度增加時(shí)吸附率不發(fā)生變動(dòng),由此可以看出樹(shù)脂在多糖濃度為1.0 mg/mL的時(shí)候達(dá)到飽和。

2.4.2 解吸劑體積對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸的影響 由圖8解吸曲線(xiàn)圖和實(shí)際樣液顏色變化可知,前3樣液試管基本為無(wú)色,從第4樣液試管開(kāi)始顏色變?yōu)榈S色溶液,顏色在第10樣液試管為最深的黑棕色,即該管洗脫液濃度最大,第17管開(kāi)始慢慢顏色變淺,到第20管試管開(kāi)始顏色變?yōu)榈S色且逐漸變?yōu)闊o(wú)色。由此可見(jiàn),當(dāng)葛根多糖完成基本解吸時(shí)解吸劑體積為51 mL,由圖8可看出,曲線(xiàn)對(duì)稱(chēng)性較好,解吸峰較集中,沒(méi)有明顯的曲線(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

2.4.3 葛根多糖紅外光譜分析 由圖9知,純化后的葛根多糖具有一般多糖的紅外光譜特征性結(jié)構(gòu)[12],在3401 cm-1附近出現(xiàn)較寬吸收峰是因?yàn)樘穷?lèi)O-H鍵伸縮振動(dòng)的結(jié)果。另外在2934 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是糖類(lèi)C-H鍵伸縮振動(dòng)引起的,這兩組峰均屬于多糖類(lèi)的特征吸收峰。而在1630 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為糖醛酸中自由羧基的振動(dòng)吸收峰。從以上特征峰說(shuō)明純化后的產(chǎn)物為多糖類(lèi)物質(zhì)。

圖9 葛根多糖純化后紅外掃描圖

2.5 葛根多糖分離純化結(jié)果

按照以上的最優(yōu)條件,將處理好的D101樹(shù)脂在吸附時(shí)間為8 h,吸附濃度0.75 mg/mL,樣液pH6.0,解吸時(shí)間為3 h,乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下對(duì)葛根多糖進(jìn)行靜態(tài)分析,再用層析柱法進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化。對(duì)純化后的樣品進(jìn)行紅外掃描,由紅外譜圖得知純化后的葛根多糖具有多糖特征吸收峰。對(duì)純化后的葛根多糖進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算出多糖含量為55.34%,而未純化之前多糖含量為30.23%,說(shuō)明此方法純化效果良好。

2.6 葛根多糖的抗氧化性能研究

2.6.1 葛根多糖溶液濃度對(duì)清除DPPH自由基的影響 從圖10可知,單寧酸的清除率最大,其次為純化后的多糖溶液,未純化的多糖溶液清除率最小,三者的清除率隨濃度的增加而增加,但清除率變化曲線(xiàn)比較平緩。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),單寧酸、純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在濃度為1.2 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基有最大清除率,分別為91.78%、81.74%、65.28%。

圖10 樣液濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響

2.6.2 葛根多糖溶液濃度對(duì)清除羥基自由基的影響 從圖11可知,單寧酸對(duì)羥基清除率最大,整體隨濃度的增加平緩的上升,純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在0.4～0.8 mg/mL隨濃度的增加呈較陡的上升趨勢(shì),而在0.8～1.2 mg/mL濃度范圍變?yōu)槠骄徤仙厔?shì)。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),單寧酸,純化后多糖溶液和未純化多糖溶液在濃度為1.2 mg/mL時(shí)對(duì)·OH有最大清除率,分別為90.94%、85.11%、77.36%。

圖11 樣液濃度對(duì)羥基自由基清除率的影響

2.6.3 葛根多糖抗氧化性結(jié)果 在研究葛根多糖抗氧化性時(shí),以單寧酸為試驗(yàn)對(duì)照組,分析葛根多糖純化前后對(duì)DPPH·和·OH的清除率。未純化的葛根多糖對(duì)DPPH·和·OH的清除率為65.28%和77.36%,其純化后對(duì)DPPH·和·OH的清除率為81.74%和85.11%。結(jié)果顯示純化后的葛根多糖相比未純化時(shí)抗氧化清除自由基能力增強(qiáng),且抗氧化能力隨著多糖純度的增大而增強(qiáng),說(shuō)明葛根多糖成分在抗氧化作用中起著主要作用,可能因?yàn)榧兓蟮母鸶嗵侵刑侨┧岬暮吭龈?而糖醛酸含量的增高與自由基清除能力和抗氧化活性存在直接關(guān)系[13]。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)尋找到D101型大孔樹(shù)脂對(duì)葛根多糖具有較好的吸附和解吸效果,對(duì)多糖的吸附率和解吸率分別為60.39%和70.35%。對(duì)葛根多糖溶液進(jìn)行純化研究,當(dāng)溶液pH為6.0,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,吸附時(shí)間8 h,解吸時(shí)間3 h,吸附濃度0.75 mg/mL時(shí)為最佳純化工藝,純化后的葛根多糖具有多糖特征吸收峰,且純化后葛根多糖純度達(dá)到55.34%。由于多糖純度的提高,純化后多糖對(duì)DPPH·最大清除率達(dá)到81.74%和85.11%。葛根多糖較強(qiáng)的抗氧化性,在糖類(lèi)功能性食品藥物和醫(yī)療中應(yīng)用廣泛,這對(duì)葛根的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。