百香果黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

李欣燃,張華興,翁貴英,王緒英

(六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,貴州六盤水 553000)

百香果(Passifloraedulis),又名土羅漢果、雞蛋果及洋石榴等,始載于《廣州植物志》,屬于西番蓮科西番蓮屬植物,因其具有數(shù)十種水果香味,因而被稱為“百香果”[1-2]。其水份含量豐富,味酸甜可口,不僅可以用來鮮食,還被用來作為果汁[3]、果酒[4]及果醬[5]的原料,深受人們喜愛?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),百香果及其果皮具有控制血糖[6-7]、抗高血壓[8-9]、抗炎減脂[10]、護肝保腎[11]和調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)功能[12]等多種生物學(xué)功能,且已有研究將百香果皮粉加入面粉[13]或漢堡包[14]中作為食品原料,可以說百香果具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值,有著較大的開發(fā)潛力。

黃酮類化合物是植物體內(nèi)重要的次級代謝產(chǎn)物,是植物發(fā)揮多種生物學(xué)活性的物質(zhì)基礎(chǔ),對人體健康起到重要作用[15-16]。已有研究表明,百香果果肉及果皮中含有黃酮類化合物,并且是其發(fā)揮多種生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18]。百香果保鮮時常較短,在自然條件下,果實成熟5 d后即開始腐敗[19];而對于果皮,在百香果食用或加工過程中多數(shù)被作為廢棄物扔掉,因此,百香果果肉及果皮的進一步開發(fā),尤其是對其中黃酮化合物做進一步的開發(fā)研究,對百香果資源的節(jié)約以及合理利用具有重要意義,然而目前對于百香果黃酮化合物的研究相對較少,對于百香果果汁的黃酮提取工藝研究不多。

本研究通過響應(yīng)面法對百香果果肉及果皮黃酮的提取工藝進行優(yōu)化,進而對提取的黃酮類化合物抗氧化活性進行初步評價,以期為百香果黃酮的提取提供參考數(shù)據(jù)，為百香果資源進一步的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果 購于六盤水市沃爾瑪超市,經(jīng)六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)教研室鑒定為紫色百香果(PassifloraedulisSims var.edulis);蘆丁標準品(純度﹥98%) 北京中科質(zhì)檢生物科技有限公司;L-抗壞血酸(USP級別) 生工生物工程(上海)股份有限公司;H2O2(30%)、鹽酸、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 國產(chǎn)分析純。

BGZ-30電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-2100型紫外可見分光光度計 北京東西分析儀器有限公司;HYF-P0107便攜式攪拌機 海爾集團公司;SB-800DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;TD5自動脫帽離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;ATY124電子分析天平 沈陽龍騰電子標量儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線建立 取1 mg/mL蘆丁標準品0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中,分別加入5% NaNO20.7 mL,混勻放置6 min,分別加10% Al(NO)30.7 mL,混勻放置6 min,分別加1 mol/L NaOH 10 mL后,再加乙醇補齊至25 mL,混勻放置15 min后,在波長510 nm處分別測量其吸光度。并繪制線性回歸方程:y=11.09x+0.002(R2=0.995)。

1.2.2 原料處理 取果皮自然晾干3 d,40 ℃恒溫烘箱烘至恒重,粉碎后過40目篩待用;取果肉于榨汁機進一步攪拌細碎待用,取磨碎的1 mL果肉樣品稱重三次,平均值為1.016 g,為方便后續(xù)試驗,按1 mL=1 g計算。

1.2.3 單因素實驗 將果肉分別按照以下三個因素進行實驗,料液比1∶2、1∶6、1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g/mL,超聲時間50 min,乙醇體積分數(shù)70%;提取時間20、30、40、50、60、70 min,料液比1∶6 g/mL,乙醇體積分數(shù)70%;乙醇體積分數(shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比1∶6 g/mL,超聲時間50 min。

將果皮分別按照以下三個因素進行實驗,料液比1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90 g/mL,超聲時間40 min,乙醇體積分數(shù)70%;超聲時間20、30、40、50、60、70 min,料液比1∶50 g/mL,乙醇體積分數(shù)70%;乙醇體積分數(shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比1∶50 g/mL,超聲時間40 min。以上所有試驗保持超聲功率800 W,超聲溫度50 ℃不變。

黃酮得率計算方法為:黃酮得率(%)=提取液中黃酮含量/百香果果肉或果皮質(zhì)量×100

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)1.2.3單因素實驗結(jié)果,分別以果肉和果皮黃酮得率為響應(yīng)值,選取表1和表2中的因素為自變量,利用Design-Expret 8.0.6軟件分別對果肉和果皮進行曲面響應(yīng)試驗,探索百香果肉和果皮黃酮提取的最優(yōu)條件。

表1 果肉響應(yīng)面因素水平設(shè)計

表2 果皮響應(yīng)面因素水平設(shè)計

1.2.5 抗氧化試驗 將百香果果肉和果皮的黃酮提取物濃縮干燥,并梯度稀釋成濃度為0.182、0.228、0.285、0.356、0.445、0.557 mg/mL黃酮待測物,分別對果肉和果皮黃酮待測物進行羥自由基清除率測定[20-21]及超氧自由基清除率測定[22-23]。

計算方法分別為:羥自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

式中:Ax為樣品檢測的吸光度;A0為不加樣品時的吸光度;Ax0為不加顯色劑H2O2的吸光度。

超氧自由基清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

式中:Ax為樣品檢測的吸光度;A0為不加樣品時的吸光度;Ax0為不加鄰苯三酚時的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件和Microsoft Excel 2007進行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)處理及繪圖,以上數(shù)據(jù)均為3次平行試驗均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果肉及果皮的單因素實驗

由圖1可知,果肉的黃酮得率在料液比為1∶6 g/mL時達到最大,果皮的黃酮得率在料液比為1∶50 g/mL時達到最大(圖2),說明此時二者的黃酮析出量基本已經(jīng)達到平衡,隨著料液比的進一步增加,黃酮得率略有下降,可能由于不同料液比導(dǎo)致溶劑中黃酮濃度差不同,從而影響提取效率[24],考慮到溶劑成本,分別選擇在1∶6、1∶50 g/mL左右進行優(yōu)化試驗;果肉(圖3)和果皮(圖4)黃酮得率分別在超聲時間50和40 min時達到最大,隨著時間的延長,黃酮得率略有下降,分析產(chǎn)生的原因可能是隨著時間的延長,黃酮類物質(zhì)可能部分被氧化,且溶劑中的一些熱敏組分被破壞[25];果肉(圖5)和果皮(圖6)的黃酮得率均在乙醇體積分數(shù)為70%時達到最大,可能是此濃度溶劑與百香果黃酮極性最接近,析出量較大,當濃度高于70%時,極性差異增多,同時會引起醇溶性等其他物質(zhì)的析出,從而間接影響黃酮得率[25]。

圖1 料液比對百香果果肉黃酮得率的影響

圖2 料液比對百香果果皮黃酮得率的影響

圖3 提取時間對百香果果肉黃酮得率的影響

圖4 提取時間對百香果果皮黃酮得率的影響

圖5 乙醇體積分數(shù)對百香果果肉黃酮得率的影響

圖6 乙醇體積分數(shù)對百香果果皮黃酮得率的影響

2.2 果肉響應(yīng)法優(yōu)化工藝

由表3可知,以百香果果肉黃酮類化合物得率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計三因素三水平試驗,得到果肉黃酮類化合物擬合回歸方程R=-5.22556+0.070062A+0.20463B+0.021825C+8.75000×10-4AB-5.00000×10-4AC-2.50000×10-5BC-4.95312×10-3A2-2.06750×10-3B2-1.17500×10-4C2。其中R為果肉黃酮類化合物得率、A為料液比、B為提取時間、C為乙醇體積分數(shù)。

表3 果肉 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)上述數(shù)據(jù)得到各項系數(shù)的方差分析結(jié)果見表4,該回歸模型P<0.0001差異極顯著,失擬誤差P=0.8325,沒有顯著性差異,表明該回歸模型與真實值擬合度較高,其中A、A2和B2為差異極顯著(P<0.01),AB為差異顯著(P<0.05),三個因素對百香果果肉黃酮得率的影響大小依次為A>B>C。

表4 果肉響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析表

由圖7可知,AB交互作用的響應(yīng)面坡度較陡峭,說明其對百香果果肉黃酮得率具有較顯著的影響,AC和BC交互作用的響應(yīng)面坡度較平緩,說明二者對果肉黃酮得率影響較小。

圖7 各因素交互作用對從果肉提取黃酮得率影響的響應(yīng)面

2.3 果皮響應(yīng)法優(yōu)化工藝

由表5可知,以百香果果皮黃酮類化合物得率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計三因素三水平試驗,得到果皮黃酮類化合物擬合回歸方程R=-17.79625+0.058750A+0.23212B+0.40936C+2.02500×10-3AB-1.25000×10-4AC-8.50000×10-4BC-1.40000×10-3A2-4.77500×10-3B2-3.12500×10-3C2。其中R為果皮黃酮類化合物得率、A為料液比、B為提取時間、C為乙醇體積分數(shù)。

表5 果皮Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

圖8 各因素交互作用對從果皮提取黃酮得率影響的響應(yīng)面

根據(jù)表5數(shù)據(jù)得到各項系數(shù)的方差分析結(jié)果見表6,該回歸模型P<0.0001差異極顯著,失擬誤差P=0.6218,無顯著性差異,表明該回歸模型與真實值擬合度較高,其中A、B、AB、BC、A2、B2和C2均為差異極顯著(P<0.01),三個因素對百香果果肉黃酮得率的影響大小依次為B>A>C。

表6 果皮響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析表

由圖8可知,AB交互作用的響應(yīng)面坡度陡峭,說明二者對百香果果皮黃酮得率具有顯著的影響,BC、AC交互作用的響應(yīng)面坡度較平緩,說明其對果皮黃酮得率影響較小。

2.4 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果2.2得到果肉黃酮提取的最優(yōu)條件為料液比1∶8 g/mL,超聲時間50.75 min,乙醇體積分數(shù)70.44%時,果肉黃酮得率為1.02%,為方便試驗操作,將其提取條件優(yōu)化為料液比1∶8 g/mL,超聲時間51 min,乙醇體積分數(shù)70%,進行三次平行試驗,得到百香果果肉黃酮平均提取率為1.04%,其與預(yù)測值的相對標準偏差為1.96%。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果2.3得到果皮黃酮提取的最優(yōu)條件為料液比1∶47.18 g/mL,超聲時間40.55 min,乙醇體積分數(shù)70.11%時,果皮黃酮得率為2.66%,為方便試驗操作,將其提取條件優(yōu)化為料液比1∶47 g/mL,超聲時間41 min,乙醇體積分數(shù)70%,進行三次平行試驗,得到百香果果皮黃酮平均提取率為2.71%,其與預(yù)測值的相對標準偏差為1.88%。

由此說明以上結(jié)果可見該方法可靠,結(jié)果準確。

2.5 百香果果肉和果皮黃酮提取物體外抗氧化活性檢測

由圖9～圖10可知,在質(zhì)量濃度0.182～0.557 mg/mL范圍內(nèi),百香果果肉和果皮的黃酮類化合物的抗氧化能力與VC的變化趨勢基本一致,當果肉和果皮黃酮類化合物的濃度達到0.285 mg/mL時,其羥自由基的清除率分別達到51%和55%,超氧負離子的清除率分別到達51%和58%。

圖9 不同濃度果肉、果皮黃酮提取物及抗壞血酸對羥自由基清除率

圖10 不同濃度果肉、果皮黃酮提取物及抗壞血酸對羥自由基清除率

3 結(jié)論

本試驗以百香果的果肉與果皮為研究對象,采用超聲輔助的提取方案,通過響應(yīng)面法對總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。對于果肉的最佳工藝為:料液比1∶8 g/mL,超聲時間51 min,乙醇體積分數(shù)70%;對于果皮的最佳工藝為:料液比1∶47 g/mL,超聲時間41 min,乙醇體積分數(shù)70%。在各自最優(yōu)提取條件下,黃酮提取物的得率分別為1.04%和2.71%。體外抗氧化活性試驗的結(jié)果表明,果肉和果皮各自的黃酮提取物濃度達到0.285 mg/mL時,各自對羥自由基的清除率分別達到51%和55%,超氧負離子的清除率分別到達51%和58%,說明百香果果肉和果皮具有較好的抗氧化活性。所得的試驗結(jié)果可為百香果的進一步開發(fā)利用提供一定的理論參考。