基于高通量測序分析四川辣椒醬自然發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律

劉 洋,丁 悅,孫勁松,潘 攀,劉力嘉,張雅琳,王新惠

(成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106)

辣椒醬作為一種深受人們喜愛的調(diào)味品,在我國具有廣泛的市場,我國辣椒醬的年產(chǎn)量和年消費量均達500萬噸以上,且每年市場的規(guī)模仍穩(wěn)定增長[1]。傳統(tǒng)辣椒醬的制作一般采用自然發(fā)酵,自然發(fā)酵指將新鮮辣椒去梗破碎后加入蒜、姜等配料,利用高鹽腌制或高油腌制罐裝發(fā)酵而成[2]。自然發(fā)酵辣椒醬由自然環(huán)境中的多菌種長時間發(fā)酵,形成特有的風味物質(zhì),但與此同時辣椒本身和加工處理過程都會帶來許多雜菌,導(dǎo)致其品質(zhì)穩(wěn)定性不佳,食用安全性得不到保障[3]。因此,研究辣椒醬自然發(fā)酵過程中細菌群落演替規(guī)律,有利于提高自然發(fā)酵辣椒醬的經(jīng)濟效益和提升辣椒醬的食用安全性。

利用高通量測序技術(shù)分析環(huán)境樣品中細菌群體基因組,彌補了傳統(tǒng)微生物研究方法不能分離出環(huán)境中所有微生物的缺陷[4-5]。近年來,高通量測序技術(shù)在發(fā)酵食品行業(yè)中的運用越來越多。Hao等[6]通過對中國東北農(nóng)家大豆醬發(fā)酵過程中細菌多樣性的探究,確定大豆醬在發(fā)酵過程中存在有害菌為四聯(lián)球菌(Tetragenococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus),并確定乳桿菌為主要的菌群。利用高通量測序技術(shù)能夠探究細菌的多樣性,趙玲艷[7]通過對辣椒醬中細菌16S rRNA基因測序,發(fā)現(xiàn)線椒和米椒所制的辣椒醬在發(fā)酵過程中的細菌多樣性差別不大,且細菌多樣最大值均出現(xiàn)在發(fā)酵的中間時期。武亞婷等[8]采用高通量測序技術(shù)篩選出新疆不同地區(qū)的自然發(fā)酵辣椒醬的主要優(yōu)勢菌,篩選出鏈形植物屬(Streptophytaspp.)和乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)等新疆地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬的優(yōu)勢菌屬。大量的研究表明,高通量測序技術(shù)檢測發(fā)酵食品中的微生物的技術(shù)已經(jīng)比較成熟,通過此技術(shù)研究辣椒醬中的微生物具有一定的合理性。

川渝地區(qū)人們酷愛辣味,辣椒醬需求量巨大,研究該地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中細菌群落結(jié)構(gòu)的演替對于辣椒醬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。本研究以四川地區(qū)辣椒醬為材料,通過高通量測序技術(shù),探究其在自然發(fā)酵過程中的細菌群落多樣性以及菌落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律,以期錨定發(fā)酵過程中的功能菌和有害菌,為提高自然發(fā)酵辣椒醬的安全性,優(yōu)化辣椒醬的發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮二荊條紅辣椒、鹽、味精等 購自十陵友誼綜合市場;M2327-01Mag-Bind Plant DNA Kit(50)試劑盒 美國Omega Biotek Inc公司;無水乙醇 98%,成都科隆化學(xué)品有限公司。

Miseq測序儀 Illumina公司;5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;My Cycler型聚合酶鏈式反應(yīng)儀(polymerase chain reaction,PCR)、瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司;GR-500 型姜蒜切粒機 山東高然食品機械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣椒醬的工藝 新鮮二荊條辣椒→洗凈去?！鷵v碎→添加輔料、調(diào)料→拌勻→裝壇發(fā)酵。

1.2.1.1 操作要點 辣椒選用辣度適中、辣椒紅色素豐富的雙流二荊條辣椒。

感官指標:呈鮮紅色、質(zhì)地硬朗,個頭均勻、辣味強;椒把保留長度不得超過5 mm,不能脫帽。利用姜蒜切粒機對姜、蒜等進行切粒,粒徑均控制在2～3 mm左右。

1.2.1.2 取樣 利用無菌袋,分別對發(fā)酵期間第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d的樣品進行取樣,每次在發(fā)酵缸內(nèi)不同的位置取3個樣品作為重復(fù),一個樣品10 g,共9次,取樣的樣品分別命名為CPS-1、CPS-2、CPS-3、CPS-4、CPS-5、CPS-6、CPS-7、CPS-8、CPS-9。

1.2.2 DNA提取 稱取適量辣椒醬樣品,嚴格按照M2327-01Mag-Bind Plant DNA Kit(50)試劑盒要求提取DNA。DNA濃度測定采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測合格后進行進一步實驗。

1.2.3 PCR擴增以及測序 采用細菌16S rDNA V3～V4擴增通用引物:341F(5′-CCTACGGGRSGC AGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATC TAATC-3′)。

PCR反應(yīng)體系為:10×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL,引物(10 μmol/L)F和R各為1 μL和100 ng NDA模板,最后加ddH2O補足至40 μL。

細菌PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,反應(yīng)重復(fù) 30個循環(huán);72 ℃最終延伸 5 min,-20 ℃保存[9]。對得到的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗,對符合要求的產(chǎn)物進行后續(xù)實驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用UPARSE軟件對所有樣本的全部Effective Tags進行聚類,默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units),篩選出現(xiàn)頻率最高的OTUs序列作為代表序列[10]。使用UCLUST分類法與SILVA數(shù)據(jù)庫進行注釋分析;使用Mothur軟件計算Alpha指數(shù)、稀釋曲線,使用Vegan package計算Beta多樣性距離矩陣,并對樣品進行PCA 3D主成分分析[11]使用R軟件(Version 2.15.3)和OriginPro 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Shannon稀釋曲線

用Shannon稀釋性曲線來表征測序方法的可行性,該曲線采用隨機抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)和它們所能代表的OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線。如圖1所示,曲線變得平坦,說明隨著序列數(shù)的增加,不會出現(xiàn)更多的OTU,表明測序量足夠[12]。

圖1 自然發(fā)酵辣椒醬9個樣本的Shannon稀釋曲線

表1 辣椒醬自然發(fā)酵過程中細菌多樣性指數(shù)

2.2 主成分分析

主成分分析(Principal component analysis,PCA)是對樣本中微生物多樣性相似性和差異性可視化的方法。樣本的PCA 3D如圖2所示,百分比表示該成分對樣品差異的貢獻值,樣本間的距離越近說明樣本之間越相似。樣品CPS-1、CPS-2和CPS-3在圖中較聚集,說明這三個樣品的相似度較高。同理,樣本CPS-4、CPS-5和CPS-6相似度較高,CPS-7、CPS-8和CPS-9相似度較高。根據(jù)發(fā)酵期間樣本的相似度的特點,將樣品CPS-1、CPS-2和CPS-3對應(yīng)的發(fā)酵第0～10 d作為發(fā)酵前期,將CPS-4、CPS-5和CPS-6對應(yīng)的發(fā)酵第10～25 d作為發(fā)酵中期,將CPS-7、CPS-8和CPS-9對應(yīng)的發(fā)酵第25～40 d作為發(fā)酵后期。

圖2 9個自然發(fā)酵辣椒醬樣本的PCA 3D圖

2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反應(yīng)了樣品中微生物的豐富度和多樣性,在表1中,Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于表示微生物的豐富度,其值隨著微生物豐富度的升高而增大;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于表示微生物群落的多樣性,Shannon指數(shù)隨著群落多樣性的升高而增大,Simpson指數(shù)則隨著群落多樣性的升高而減小。Coverage值代表各樣品文庫的覆蓋率,測出的值越接近1,說明各樣品的覆蓋率也高,測序的結(jié)果越能代表真實的情況[13]。

如表1所示,所有樣本的Coverage指數(shù)都大于或等于0.99,說明測序的結(jié)果能夠真實反映樣本細菌豐度及細菌群落多樣性;通過OTU、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的變化情況可以發(fā)現(xiàn):在發(fā)酵過程中,細菌的豐富度和多樣性呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢,細菌的豐度在15 d達到最大值,多樣性在20 d達到最大值。說明辣椒醬制作完成后存在多種細菌,由于辣椒醬中營養(yǎng)物質(zhì)豐富,各種微生物在發(fā)酵的初期大量繁殖,產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)并消耗發(fā)酵體系中的氧氣,這使不適應(yīng)環(huán)境的微生物逐漸消減,適應(yīng)環(huán)境的厭氧和耐酸能力好的細菌得到很好的生長,最后又由于細菌之間的競爭關(guān)系造成發(fā)酵后期細菌群落多樣性和豐富度減小。除此之外,溫度的變化、氧氣含量變化和取樣時帶入的外來細菌的影響等,對多樣性也存在一定的影響[14]。

2.4 自然發(fā)酵的細菌OTU花瓣圖

根據(jù)獲得的OTU豐度矩陣,使用R軟件計算樣品中共有的OTU的數(shù)量,并通過OTU花瓣圖直觀的展示出樣品的OTU數(shù)目組成相似性和重疊情況。如圖3所示,9個樣本中共有OTU數(shù)目僅為10,從樣本CPS-1～CPS-9中特有的OTU數(shù)分別為19、26、22、31、30、26、33、24、27,說明辣椒醬在發(fā)酵的整個過程中細菌群落變化較大。

圖3 辣椒醬自然發(fā)酵過程中的細菌OTU花瓣圖

2.5 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 門水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)分析 由圖4可知,發(fā)酵過程中的9個樣本中,門水平上相對豐度大于0.01%的菌門類有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)5種。其中變形菌門是發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌門,厚壁菌門是辣椒醬發(fā)酵中、后期的優(yōu)勢菌門。厚壁菌門在發(fā)酵1～10 d其含量有小幅度增加的趨勢,但總量依然較小,相對豐度浮動范圍為0.52%～2.59%,發(fā)酵中期相對豐度的波動范圍為18.71%～28.56%,發(fā)酵后期相對豐度維持在75.30%～82.99%之間,對辣椒醬的發(fā)酵處于主導(dǎo)作用。變形菌門是前期的主要菌門,其在發(fā)酵前期的含量浮動在15.36%～18.04%之間,遠遠高于其他菌門,而發(fā)酵中期其生長受到抑制,相對豐度波動范圍為8.56%～12.02%,后期相對豐度波動范圍為2.57%～3.24%。相比之下擬桿菌門和放線菌門等含量較低,在整個發(fā)酵過程中相對豐度小于0.4%,且隨著發(fā)酵的進行,其生長更加受到抑制。除此之外在發(fā)酵前期還有少量醋桿菌門,平均相對豐度為0.09%,在發(fā)酵的中、后期樣本中均未檢測出。

圖4 門水平下自然發(fā)酵辣椒醬的細菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

2.5.2 屬水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)分析 在屬水平上辣椒醬發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)如圖5所示,發(fā)酵過程中相對豐度大于0.01%的分別為:乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、片球菌屬(Pediococcusspp.)、魏斯氏菌屬(Weissellaspp.)、腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、葡萄球菌屬(Staphyloccoccusspp.)、泛桿菌屬(Pantoeaspp.)、朗斯代拉菌屬(Lonsdaleaspp.)、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、新根瘤菌屬(Neorhizobiumspp.)9種。其中腸桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬分別為發(fā)酵前期、中期、后期三個階段的優(yōu)勢菌。腸桿菌屬在發(fā)酵前、中、后期平均相對豐度分別為7.95%、4.24%、1.37%,一般腸桿菌屬在發(fā)酵食品中屬于條件致病菌,其致病性不可忽略[15]。魏斯氏菌屬在樣本中的豐度呈現(xiàn)先增加后減少的波動,在發(fā)酵前、中、后期平均相對豐度分別為0.73%、21.86%和3.66%。魏斯氏菌屬可以發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等產(chǎn)酸,是形成風味的重要菌屬。乳桿菌屬在發(fā)酵前期含量較少,在第30 d時相對豐度達到68.24%。這可能是因為隨著發(fā)酵的進行,發(fā)酵體系中理化性質(zhì)如氧含量、酸含量等,達到乳桿菌屬生長的最佳值,因此其在短時間內(nèi)快速增長,并在發(fā)酵后期占主導(dǎo)地位。乳桿菌屬在辣椒醬的風味物質(zhì)形成方面起到主要的作用,此外乳桿菌屬還能減少真菌毒素的積累、降解農(nóng)藥、阻止生物胺的積累、降低蛋白質(zhì)過敏風險[16-18],還可以通過降解肌醇六磷酸來增加礦物質(zhì)的利用率[19-20],是辣椒醬發(fā)酵的主要功能菌。除此之外,在發(fā)酵的后期出現(xiàn)少量的片球菌屬(平均相對豐度0.79%),它能有效的抑制食源性致病菌[21]、加快產(chǎn)酸和風味物質(zhì)形成的速度等[22-23],對提高發(fā)酵速率、提升風味和提高安全性具有重要意義;泛桿菌屬、朗斯代拉菌屬、假單胞菌屬等都是可能引起疾病和食物腐敗的細菌[24],在發(fā)酵的初期和中期均存在于樣本中,但這幾種致病菌和致腐菌隨著發(fā)酵的進行,其生長受到環(huán)境因素和其他微生物的抑制,在發(fā)酵后期的樣本中基本未檢測出。

圖5 屬水平下自然發(fā)酵辣椒醬的細菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

對于整個發(fā)酵過程,發(fā)酵的前、中期細菌種類較多的同時雜菌也較多,隨著發(fā)酵的進行,發(fā)酵體系中理化性質(zhì)的發(fā)生改變,對發(fā)酵罐中環(huán)境耐受能力差的細菌生長受到抑制,最后演替為乳桿菌屬為主導(dǎo),少量的魏斯氏菌屬和片球菌屬共同發(fā)酵的形式。此外,各種致腐致病菌隨著發(fā)酵的進行,其生長受到抑制,最后僅剩小部分腸桿菌屬存在。但即使存在少量腸桿菌屬,說明自然發(fā)酵辣椒醬在整個發(fā)酵過程中均存在著安全隱患。

2.6 功能豐度熱圖分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一個對基因組、化學(xué)以及系統(tǒng)功能信息加以整理合并的數(shù)據(jù)庫。對樣品進行KEGG分析,利用R語言繪制熱圖。由圖6可知,在發(fā)酵整個過程中細菌較為活躍的功能基因有復(fù)制與修復(fù)(Replication and Repair)、翻譯(Translation)、膜轉(zhuǎn)運(Membrane Transport)、能量代謝(Energy Metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate 0Metabolism)、氨基酸代謝(Amino Acid Metabolism)、脂肪代謝(Lipid Metabolism)和轉(zhuǎn)錄(Transcription)等。發(fā)酵前期和中期,轉(zhuǎn)錄、脂肪代謝、氨基酸代謝、能量代謝、DNA復(fù)制、修復(fù)和翻譯等細菌的生命活動相關(guān)功能較為活躍,到發(fā)酵的后期則變得較弱。說明發(fā)酵前、中期,樣本中細菌的生長狀況較好,代謝活動較旺盛,后期無論是細菌的豐度還是物種多樣性都明顯減小,細菌的一系列生命活動變?nèi)?。發(fā)酵后期厚壁菌門占據(jù)主導(dǎo)地位,且厚壁菌門細菌的糖酵解的能力很強,這可能是發(fā)酵后期碳水化合物的代謝依然維持在很高水平造成的,同時碳水化合物代謝過程中需要膜轉(zhuǎn)運的參與,所以后期細菌膜轉(zhuǎn)運的豐度仍然很高[25]。發(fā)酵后期細菌能量代謝豐度較低,由此推測此階段細菌主要的膜轉(zhuǎn)運方式為易化擴散,此膜轉(zhuǎn)運方式為一種不需要消耗能量被動運輸方式[26]。

圖6 自然發(fā)酵辣椒醬中細菌功能豐度熱圖

3 結(jié)論

通過對自然發(fā)酵辣椒醬進行高通量測序,研究辣椒醬在發(fā)酵過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。發(fā)現(xiàn)整個發(fā)酵過程中辣椒醬的細菌群落多樣性和豐度呈先增加后減少的趨勢,并且最終低于初始值。由細菌群落的演替變化表明,自然發(fā)酵辣椒醬在發(fā)酵30 d左右成熟。整個發(fā)酵過程中,辣椒醬中的細菌群落變化較大。在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)分別為發(fā)酵前期和中后期的優(yōu)勢菌;屬水平上腸桿菌屬(Enterobacterspp.)、魏斯氏菌屬(Weissellaspp.)和乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)分別為發(fā)酵前、中、后期的優(yōu)勢菌,其中乳桿菌屬為主要功能菌屬,腸桿菌屬為主要致病菌屬。通過KEGG功能分布熱圖,表明在發(fā)酵過程中細菌的生命活動逐漸減弱,但碳水化合物代謝和膜轉(zhuǎn)運強度變化較小且豐度較高。

在辣椒醬的自然發(fā)酵的過程中,細菌群落多樣性的變化較大,隨著發(fā)酵的進行,其中主要功能菌在發(fā)酵過程的豐度增加非常明顯,主要致病菌生長受到抑制,但還有少量致病菌的存在,其隱藏的風險仍然不可忽視。如何做到既不影響辣椒醬風味,又能優(yōu)化發(fā)酵工藝和提高食用安全性,是未來辣椒醬行業(yè)研究的重點方向。