可視化跨越式滾環(huán)等溫擴(kuò)增技術(shù)在豬肉摻假檢測中的應(yīng)用

胡學(xué)佳,盧 鑫,張?zhí)N哲,徐 慧,楊 倩,趙崢山,李子英,蘇玲玲,張 偉,,3,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,河北滄州 061100;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071000)

肉及肉制品營養(yǎng)豐富,蛋白質(zhì)含量高,含有多種人體必需氨基酸,可增強(qiáng)人體免疫力[1]。然而,由于不同肉類之間存在的價格懸殊,一些不法商販為了獲得較高的經(jīng)濟(jì)利潤,用便宜的肉類代替昂貴的肉類[2-3]。近些年,肉類摻假事件層出不窮,因此公眾越來越關(guān)注肉制品的質(zhì)量和安全,同時也意識到肉類摻假帶來的危害[4]。豬肉由于其顏色和質(zhì)地與羊肉和牛肉相似,且供應(yīng)充足、價格低廉,因此常被不法商販作為牛羊肉產(chǎn)品的替代品[5-6]。在肉制品中未經(jīng)標(biāo)識而添加豬肉的摻假行為不僅損害了消費(fèi)者的利益,而且威脅到了消費(fèi)者的宗教習(xí)俗(如穆斯林教徒),甚至?xí)ωi肉過敏者的生命造成危害[7-9]。在中國,根據(jù)1553家媒體的調(diào)查報告顯示肉類摻假數(shù)量占食品摻假總數(shù)的37.78%[10]。由此可見,肉類摻假問題已經(jīng)成為我國面臨的重要問題。

表1 豬cyb t基因的引物

為了保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益,保障公眾健康,人們已經(jīng)開發(fā)了許多可以鑒定肉類產(chǎn)品的技術(shù),這些技術(shù)大多通過蛋白質(zhì)、脂類、揮發(fā)性化合物或DNA對肉類進(jìn)行檢測[11-14]。與其他技術(shù)相比,基于DNA的技術(shù)的優(yōu)勢在于其具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,對加工處理后的樣品敏感性更高[15-16]。目前基于DNA的鑒定方法有實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time PCR)[17],限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)[18],環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[19]。PCR方法在物種檢測中靈敏度高,重復(fù)率高,然而,PCR方法需要繁瑣的操作和昂貴的設(shè)備,不適合快速檢測[20-21]。LAMP作為一種新型的等溫擴(kuò)增技術(shù),可快速、靈敏地對肉制品摻假成分進(jìn)行檢測,但LAMP需要4～6個引物,引物設(shè)計復(fù)雜,且引物之間容易發(fā)生反應(yīng),容易導(dǎo)致假陽性[22-23]。因此,迫切需要一種快速、可靠、易于操作的方法對肉類摻假進(jìn)行檢測。

近幾年,跨越式等溫擴(kuò)增技術(shù)(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)作為一種省時、簡便的方法已成功用于病原菌的檢測[24-25]。SRCA技術(shù)主要利用2條引物,在強(qiáng)鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下在體外進(jìn)行等溫擴(kuò)增反應(yīng)[26]。與傳統(tǒng)PCR相比,SRCA技術(shù)操作不需要繁瑣的變溫過程和昂貴的儀器,且擴(kuò)增時間短,是快速鑒定物種的理想工具。與LAMP比較,SRCA簡化了引物設(shè)計過程,節(jié)省了約50%的檢測成本。由此可見,SRCA技術(shù)在物種鑒定方面具有很大的發(fā)展?jié)摿?。本研究采用SRCA技術(shù),建立了針對豬肉成分的檢測方法,針對豬的線粒體基因篩選特異性引物,以特異性、敏感度來評價方法的有效性。本研究旨在對肉制品中的豬肉成分進(jìn)行快速和可視化檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬肉、兔肉、鴨肉、鵝肉 購自保定當(dāng)?shù)厥袌?豬肉、蝦、雞肉、牛肉、牛肉丸、牛肉卷、醬牛肉、牛肉干、牛肉粒、牛肉水餃、羊肉包子、羊肉卷、羊排、羊肉餡餅、羊肉、羊肉串 購自保定超市;牛肉火腿、羊肉干、五香醬羊肉 購自淘寶;血液、細(xì)胞和動物組織基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;DNA片段回收試劑盒、BstDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;BamhI限制性內(nèi)切酶 大連寶生物工程有限公司;SYBR Green I染料 北京索萊寶科技有限公司;引物 北京華大基因公司。

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo scientific公司;TGL16A臺式離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;PCR擴(kuò)增儀 美國Applied biosystems公司;DXY-33A 型電泳儀 北京六一儀器廠;JY04S-3E 凝膠成像儀 北京君意電泳設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取豬、牛、馬、蝦、山羊、兔、雞、鴨、鵝等9種不同動物的新鮮肌肉組織樣本。將各待檢肉樣分別單獨(dú)放入攪拌器中制成肉泥,再利用液氮將其研磨成均勻糊狀,最后將處理好的動物組織樣本保存于-20 ℃,直至提取DNA。

1.2.2 DNA提取 分別取100 mg各動物組織樣品,使用血液、細(xì)胞和動物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計測定基因組DNA濃度和純度,最后將DNA基因組保存在-20 ℃直至使用。

1.2.3 引物設(shè)計 線粒體基因由于其分布的普遍性、序列和結(jié)構(gòu)的相對保守性而被廣泛的應(yīng)用于物種的鑒定。因此本研究選用線粒體cybt基因序列(GenBank登錄號:FJ160763.1)為豬肉檢測的目的基因,利用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計。最后,由北京華大基因合成引物。豬肉SRCA反應(yīng)的特異性引物見表1。

1.2.4 SRCA與PCR的反應(yīng)條件和程序 SRCA反應(yīng)總體系為20 μL,包括MgSO4(2.5 mmol/L),dNTPs(2.5 mmol/L),10×ThermoPol緩沖液(2 μL),正反向引物(1 μmol/L),DNA模板(2.5 μL),和BstDNA聚合酶(8 U),無菌去離子水將體系補(bǔ)足至20.0 μL。然后將反應(yīng)體系混合液置于94 ℃水浴鍋中預(yù)變性3 min,冰浴2 min,再于62 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,最后在80 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)。

PCR的反應(yīng)體系總體積共25 μL,包括DNA模板(1 μL),10 μmol/L正反向引物(1 μL),2×Taq PCR Master Mix(11 μL),無菌去離子水將體系補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序為:經(jīng)95 ℃預(yù)變性5 min,然后在94 ℃變性1 min、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s之間進(jìn)行30個循環(huán),循環(huán)完畢后于72 ℃再延伸45 s。

1.2.5 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析 為了確定SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段,本研究對SRCA產(chǎn)物進(jìn)行酶切和測序分析。使用BamhI 1 μL,10×Buffer 2 μL,豬的擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL,無菌去離子水補(bǔ)足至20 μL,37 ℃孵育1 h。最后,將豬的酶解產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳條帶。同時,將擴(kuò)增片段送至北京華大基因公司進(jìn)行測序。

1.2.6 靈敏度試驗 為了確定SRCA方法檢測豬肉DNA的靈敏度。本研究使用無菌去離子水將豬肉DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,最終豬肉的模板DNA濃度范圍為6.5×107～6.5×10-1fg/μL。最后采用凝膠電泳和熒光可視法觀察試驗結(jié)果,并對試驗結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗證。

1.2.7 人工污染模擬樣品 為了驗證SRCA方法的準(zhǔn)確性且更好的模擬市場中摻假豬肉的現(xiàn)象。本研究將豬肉按100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0(w/w)的比例添加到牛肉中,制備摻假樣品。分別利用SRCA和PCR兩種方法檢測牛肉中摻假的豬肉。

1.2.8 商業(yè)樣品驗證 本研究在中國保定農(nóng)貿(mào)市場及超市收集了66種沒有標(biāo)識豬肉成分的商業(yè)肉類產(chǎn)品,通過與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 3309-2018)檢測的豬肉成分結(jié)果相比較,確定SRCA反應(yīng)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。所有的檢測都重復(fù)三次。靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度計算公式如下[24]:

敏感性(%)=真陽性/(真陽性+假陰性)×100

特異性(%)=真陰性/(真陰性數(shù)+假陽性)×100

符合率(%)=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陰性+真陰性+假陽性)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

普通SRCA和普通PCR結(jié)果通過電泳圖譜分析,熒光可視化SRCA通過觀察熒光信號進(jìn)行分析。每個樣品至少重復(fù)3次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRCA反應(yīng)結(jié)果分析

將SRCA反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察,SRCA陽性擴(kuò)增產(chǎn)物長度呈階梯狀增加(圖1A),而陰性對照(沒有模板)不顯示擴(kuò)增條帶。通過添加熒光染料SYBR Green I觀察SRCA擴(kuò)增結(jié)果,如圖1B所示,陽性樣品(管2)肉眼可見綠色熒光,陰性對照(管1)保持原來的橙色。

圖1 SRCA反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物分析

2.2 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物的測序和酶切分析

通過測序分析SRCA陽性擴(kuò)增產(chǎn)物,測序結(jié)果(圖2A)與引物設(shè)計的cybt基因具有100%的同源性,證明SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中含有目標(biāo)序列的串聯(lián)重復(fù)單位。為更加全面的驗證SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物是否均按照上述規(guī)律擴(kuò)增,本研究利用BamHI限制性內(nèi)切酶對SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析。根據(jù)測序結(jié)果計算可知,酶切產(chǎn)物是由大量的78 bp DNA片段和少量43和31 bp DNA片段組成。從圖2B可知,43和31 bp DNA片段大小相近,因此在凝膠電泳上不能分離,但酶切產(chǎn)物與測序結(jié)果中計算出來的結(jié)果大致符合。因此,測序分析和限制性內(nèi)切酶驗證結(jié)果均表明,SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物是通過豬的cybt靶序列特異性擴(kuò)增得到的。

2.3 引物特異性

SRCA引物的選擇是決定檢測特異性的重要因素。選取9個已知的肉類(包括豬肉)來檢測引物的特異性。結(jié)果如圖3A所示,豬肉DNA的SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道2)呈現(xiàn)出典型階梯狀陽性擴(kuò)增條帶,牛肉、馬肉、蝦肉、山羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉和鵝肉DNAs的SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道3～10)均未見擴(kuò)增條帶,呈陰性結(jié)果。SRCA熒光可視法的特異性結(jié)果如圖3B所示,豬肉模板的擴(kuò)增產(chǎn)物(管2)顯示綠色熒光為陽性結(jié)果,其它肉類模板的擴(kuò)增產(chǎn)物均為陰性結(jié)果呈橙色。結(jié)果表明,本研究選用的引物在SRCA反應(yīng)中對豬肉DNA具有明顯的特異性。

圖2 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)果

圖3 豬肉的SRCA引物特異性分析

2.4 SRCA的檢測靈敏度

靈敏度的測定是建立SRCA方法的第一步。首先,將豬肉模板進(jìn)行10倍梯度稀釋,然后取1 μL稀釋后的DNA模板進(jìn)行反應(yīng)。如圖4A所示,當(dāng)豬肉模板濃度為6.5×107～6.5×101fg/μL時,擴(kuò)增條帶明顯,小于6.5×101fg/μL時則不顯示擴(kuò)增條帶,因此,SRCA凝膠電泳法檢測豬肉的靈敏度為6.5×101fg/μL;熒光可視化法檢測豬肉DNA靈敏度的結(jié)果如圖4C所示,模板濃度在6.5×107～6.5×100fg/μL時,擴(kuò)增產(chǎn)物顯示綠色熒光,小于此濃度范圍則呈橙色,由此可得,SRCA熒光可視法檢測豬肉成分的靈敏度為6.5×100fg/μL;PCR法檢測豬肉DNA,隨著豬肉DNA的濃度逐漸減小,擴(kuò)增條帶逐漸模糊變暗,直至6.5×102fg/μL擴(kuò)增條帶消失不見,所以,PCR法檢測豬肉DNA的靈敏度為6.5×103fg/μL(圖4B)。結(jié)果表明,SRCA熒光可視法的靈敏度比電泳法高10倍,比常規(guī)PCR法高1000倍。

圖4 SRCA靈敏度分析

2.5 人工污染牛肉中豬肉的檢測

牛肉中豬肉的摻加比例為100%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0(w/w)。SRCA反應(yīng)結(jié)果如圖5A所示,當(dāng)豬肉的添加量為100%～0.01%時,擴(kuò)增條帶清晰可見;當(dāng)豬肉添加量小于0.01%時,則觀察不到擴(kuò)增條帶。熒光可視法檢測結(jié)果如圖5C可見,當(dāng)豬肉添加量為100%～0.01%時,SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物均顯示綠色熒光,當(dāng)豬肉添加量為0.005%時,熒光信號消失,呈橙色。PCR法檢測豬肉含量范圍為100%～0.1%時,擴(kuò)增條帶清晰可見,豬肉含量小于0.1%時,擴(kuò)增條帶不顯示。結(jié)果表明,SRCA熒光可視法可檢測出0.01%的豬肉含量,而PCR法僅能檢測出0.1%的豬肉含量。

2.6 NY/T 3309-2018及SRCA方法對實際肉制品中豬肉檢出率的比較與分析

本研究利用NY/T 3309-2018方法及建立的SRCA方法對實際購買的66份肉制品進(jìn)行檢測,通過NY/T 3309-2018方法檢出含豬肉的真陽性樣品數(shù)為35個,SRCA方法檢出含豬肉的真陽性樣品數(shù)目為36個。與NY/T 3309-2018方法相比,計算可得SRCA方法的敏感性為100.00%,特異性為96.66%,符合率為98.48%(表2)。

表2 SRCA方法評價

3 結(jié)論與討論

隨著消費(fèi)者的消費(fèi)水平日益提高,肉制品的質(zhì)量成為消費(fèi)者選擇肉制品的重要因素。但是肉制品摻假事件層出不窮,為了保護(hù)消費(fèi)者利益,維護(hù)市場公平,本研究建立了一種新的檢測肉制品中的豬肉成分的分子生物學(xué)方法。該技術(shù)只用一對引物,在Bst DNA聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。與PCR相比,SRCA反應(yīng)不需要熱循環(huán)儀,在水浴鍋等恒溫儀器中即可完成擴(kuò)增,反應(yīng)體系更加簡單;與LAMP相比,SRCA引物設(shè)計方便,同時避免了由于引物交錯導(dǎo)致不能有效的擴(kuò)增目的片段的問題,此外,SRCA的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過測序來驗證結(jié)果的正確性。與RCA相比,SRCA不需要鎖式探針進(jìn)行環(huán)化,節(jié)約成本,操作簡單,同時能夠?qū)崿F(xiàn)熒光可視化的檢測,避免了繁瑣的電泳過程,節(jié)約時間。

圖5 人工污染模擬樣品豬肉成分SRCA分析

目前有研究表明線粒體存在于大多數(shù)細(xì)胞中,且線粒體基因在種屬間具有高度特異性和保守性,故可達(dá)到較高靈敏度而易于種源的研究[28]。因此,本研究針對豬肉的線粒體cyb t基因設(shè)計合成了SRCA引物進(jìn)行擴(kuò)增,實驗結(jié)果顯示該引物對豬肉DNA特異性高。

本研究建立了一種快速、靈敏的SRCA熒光可視法檢測肉制品中的豬肉摻假的方法,該方法的靈敏度為6.5 fg/μL,可檢測出豬肉含量為0.01%的樣品。SRCA熒光可視法僅需一對引物就可以進(jìn)行特異性擴(kuò)增反應(yīng),不需要昂貴的熱循環(huán)儀,并且可以避免電泳的使用,因此,該方法靈敏度高,特異性強(qiáng),縮短了檢測時間,降低了檢測成本,為肉制品摻假的檢測提供了新方法。綜上所述,SRCA熒光可視法在物種鑒定方面具有巨大的應(yīng)用價值。