氧化對兔肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)、乳化性和凝膠性的影響研究

葉鳳凌,池玉閩,周敏之,王 琴,賈利蓉,*,董 怡,*

(1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610065;2.渭南市食品藥品檢驗所,陜西渭南 714000)

兔肉不僅含有人體所需的8種必需氨基酸，還是一種高蛋白質(zhì)、高n-3多不飽和脂肪酸、低脂肪、低膽固醇的健康肉類[1],其是鉀、磷、硒、B族維生素等營養(yǎng)素的良好來源[2]。兔肉的營養(yǎng)特性滿足了現(xiàn)代消費者對健康生活方式的渴望,具有廣泛的市場。肌原纖維蛋白(Myofibrillar Protein,MP)是兔肉中最重要的蛋白質(zhì),主要包括肌球蛋白、原肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和肌鈣蛋白等,其含量占肌肉總蛋白含量的60%左右,因此MP的結(jié)構(gòu)及功能特性與肉品的凝膠性、表面疏水性、流變學(xué)特性、持水性、乳化性、質(zhì)構(gòu)特性等性質(zhì)密切相關(guān),直接影響著肉品品質(zhì)[3]。

兔肉中豐富的不飽和脂肪酸使其具有很高的營養(yǎng)價值,也使其具有較高的油脂氧化敏感性[4]。肉品中脂質(zhì)氧化的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、金屬離子和其他來源于肌肉或在肉類加工過程中產(chǎn)生的氧化劑的影響而導(dǎo)致氧化損傷[5-7]。蛋白質(zhì)氧化可引起蛋白質(zhì)的骨架和側(cè)鏈的改變,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8]。這些結(jié)構(gòu)變化可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能改變,包括肽主鏈的斷裂、交聯(lián)、展開,氨基酸殘基的氧化修飾[9-10]等蛋白結(jié)構(gòu)的改變,以及蛋白的持水性、乳化性、凝膠性等功能性質(zhì)的變化[11],從而影響肉品質(zhì)量和肉制品的加工性能[8]。

肉品中的蛋白質(zhì)氧化是通過類似于脂質(zhì)氧化的自由基鏈式反應(yīng)進行的[12]。2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH)是一種水溶性自由基引發(fā)劑,其熱解生成的烷過氧自由基(ROO·)能夠引發(fā)脂質(zhì)氧化[13]。烷過氧自由基具有反應(yīng)速率常數(shù)高的特點,可以大面積作用于蛋白質(zhì),對其進行氧化修飾,造成蛋白質(zhì)氨基酸殘基的氧化損傷,改變蛋白的聚集程度,影響MP表面疏水性、乳化性、凝膠性等多種功能性質(zhì),從而影響肉品的營養(yǎng)性[14-16]。

我國是世界上最主要的兔肉生產(chǎn)和消費國,在一定程度上中國的兔肉制品及其加工的發(fā)展代表了兔肉制品在亞洲乃至世界的發(fā)展趨勢,但是目前肉及肉制品的蛋白氧化研究主要集中在屠宰后,肉品的宰后成熟、處理方式、加工及儲運過程中蛋白質(zhì)的氧化變性對肉品品質(zhì)的影響,且多針對豬肉[17]、牛肉[18]、魚肉[19]及禽類[20],對兔肉蛋白氧化的研究相對較少。目前,兔肉消費以原料肉為主,市場上銷售的即食兔肉產(chǎn)品種類非常有限[21],我國學(xué)者對兔肉的研究還處于初步階段[22],且多集中在:通過改變飼養(yǎng)條件和飼料組分提高兔肉質(zhì)量[23-24],優(yōu)化保鮮條件維持兔肉品質(zhì)[25],不同風(fēng)味兔肉產(chǎn)品的研發(fā)[26],以及兔肉脂質(zhì)中脂肪酸組成及氧化作用[27]等方面。理論研究的不足使我國兔肉產(chǎn)品技術(shù)含量較低,加工成本高,缺少核心競爭力,產(chǎn)品附加值低,不利于我國兔肉產(chǎn)品的加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本研究通過誘導(dǎo)AAPH熱降解產(chǎn)生ROO·作為油脂氧化的代表性自由基中間體,作用于兔肉MP,以研究不同氧化程度下兔肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化,以期為肉類產(chǎn)品中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化之間相關(guān)性的深入研究提供依據(jù),為兔肉加工過程中的氧化控制、品質(zhì)管理、技術(shù)改造及工藝配方的改進提供理論指導(dǎo),有利于深化兔肉的綜合加工與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屠宰的四川白兔(體重2500～2900 g) 購自中國四川省成都市當(dāng)?shù)厥袌?氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、尿素、十二烷基磺酸鈉、2,4-二硝基苯肼 均為分析純,成都科龍化工試劑廠;乙酸乙酯、無水乙醇、鹽酸 均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;EDTA、甘氨酸、鹽酸胍、Tris BioFroxx公司;DNPH 源葉生物公司;溴酚藍 成都金山化學(xué)試劑有限公司;AAPH 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 Biosharp公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 Solarbio公司。

1736R高速冷凍離心機 Labogene公司;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Universal Hood II凝膠電泳儀 BIO-RAD公司;Synergy H1多功能微孔板檢測儀 BioTek Instruments,Inc;UV-18008PC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 Stable Micro Systems Ltd;SQP電子天平 奧多利斯科學(xué)儀器有限公司;FSH-2A可調(diào)高速勻漿機 常州潤華電器有限公司;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔肉MP的提取 參考Xiong等[28]的方法,并進行了適當(dāng)修改。從兔肉背長肌中提取MP,用攪拌器將約80 g肌肉切碎并斬拌60 s,使其成為均勻的肉糜,加入4倍體積的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L,含150 mmol/L NaCl,25 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2和4 mmol/L EDTA)。使用勻漿機以10000 r/min在冰水浴中持續(xù)均質(zhì)60 s?；旌衔锝?jīng)兩層紗布過濾,濾液在4 ℃,5000×g條件下離心15 min,沉淀用KCl溶液(pH7.0,50 mmol/L)和PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L,不含鹽)洗滌兩次。所獲沉淀為MP提取物,冷藏并在72 h內(nèi)使用。

1.2.2 AAPH熱分解建立ROO·氧化體系 兔肉MP的氧化是參考Xiong等[28]的方法,并進行適當(dāng)修改。將1.2.1中提取得到的兔肉MP以牛血清蛋白(BSA)為標準,用雙縮脲法測定其濃度,并用0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋MP溶液使蛋白濃度為30 mg/mL,與不同濃度的AAPH(0、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)水溶液在37 ℃下避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,立即將混合物在4 ℃、6000×g條件下離心15 min以去除AAPH,并用蒸餾水洗滌兩次。對照組MP(30 mg/mL)懸浮于含0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)后,立即在4 ℃、6000×g條件下離心15 min,并用蒸餾水洗滌兩次。

1.2.3 羰基含量的測定 MP的羰基含量參照Oliver等[29]所述方法測定,并進行適當(dāng)修改。將不同氧化程度的MP分散在含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)中,蛋白濃度統(tǒng)一調(diào)整為4 mg/mL(MP以BSA為標準,用雙縮脲法測定其濃度)。將200 μL MP溶液加入200 μL 0.01 mol/L的2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH;溶于2 mol/L HCl中)中,并在室溫下避光反應(yīng)1 h。在反應(yīng)期間反應(yīng)液每15 min渦流混合一次。加入100 μL 50%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)溶液以終止反應(yīng),并于4 ℃、11000×g條件下離心5 min,沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合物(1∶1,v/v)洗滌3次,于通風(fēng)櫥內(nèi)揮干試劑,37 ℃水浴溶解于500 μL 6 mol/L鹽酸胍溶液(溶于2 mol/L HCl)中30 min,再次離心。上清液在370 nm處測量吸光度。不含DNPH的2 mol/L HCl溶液作為對照組。羰基含量計算公式:

式中:A表示370 nm波長處的吸光度;n表示稀釋倍數(shù);ε表示摩爾吸光系數(shù)22000/(L/(mol·cm));ρ表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.4 巰基的測定 參照Zhang等[30]的方法,并適當(dāng)修改。將50 μL不同氧化程度的MP溶液(用上文所述NaCl的PBS緩沖液稀釋樣品至2 mg/mL),10 μL含DTNB(10 mmol/L)的Tris-Gly溶液(pH8.0)和200 μL含8 mol/L尿素的Tris-Gly溶液(pH8.0)依次添加到96孔板中。將混合物在25 ℃下避光反應(yīng)30 min,使用酶標儀在412 nm處測定吸光度。對照組用不含DTNB的Tris-Gly溶液(pH8.0)處理。最終結(jié)果以蛋白巰基含量(nmol/mg肌原纖維蛋白)表達。

式中:A表示412 nm波長處的吸光度;n表示稀釋倍數(shù);ε表示摩爾吸光系數(shù)136000/(L/(mol·cm));ρ表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.5 二聚酪氨酸含量的測定 參考李學(xué)鵬等[31]所述的方法測定二聚酪氨酸含量,并適當(dāng)修改。將不同氧化程度的MP溶液(用上文所述NaCl的PBS緩沖液稀釋樣品至0.2 mg/mL)和含0.6 mol/L KCl的PBS緩沖液(pH6.0,20 mmol/L)以體積比1∶3混合均勻。用濾紙過濾,收集濾液。蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測定。濾液在激發(fā)波長325 nm,發(fā)射波長420 nm條件下測定熒光強度。二聚酪氨酸的量以相對熒光值A(chǔ)U表示,即熒光強度除以蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 表面疏水性的測定 參考Sun等[32]所述的方法對表面疏水性進行測定。將100 μL溴酚藍溶液(1 mg/mL)與0.5 mL 不同氧化程度的MP溶液(4 mg/mL)充分混合。對照組用PBS緩沖液(pH7.0)替代MP溶液。25 ℃下水浴振蕩10 min后在8000 r/min下離心10 min。上清液用含0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)按10∶1稀釋。在595 nm處測定稀釋液的吸光度,選擇PBS緩沖液作為空白。以下公式給出的溴酚藍結(jié)合量用作疏水性指數(shù):

1.2.7 內(nèi)源性熒光強度的測定 參考Xu等[33]的方法,用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至0.5 mg/mL。對樣品掃描內(nèi)源性熒光光譜(Ex:295 nm,Em:308～400 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2 nm)。不含蛋白的0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)作為空白對照。

1.2.8 粒徑的測定 參考Bao等[34]的方法,用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至1 mg/mL。在室溫下,以PBS緩沖液作為分散劑,使用粒度儀測定MP的粒徑分布,每個樣品進行12次分析。

1.2.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 參考Flores等[35]的方法并適當(dāng)修改。將不同氧化程度的MP溶液(8 mg/mL)用上樣緩沖液1∶1稀釋,然后沸水浴加熱3 min,SDS-PAGE采用12%丙烯酰胺分離膠和4%丙烯酰胺濃縮膠。標記蛋白選擇分子量為11～245 kDa。每孔加入10 μL樣品。電泳在電泳緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,384 mmol/L甘氨酸,0.1%十二烷基硫酸鈉,pH8.3)中進行。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(R-250)染色0.5 h,用含10%甲醇和10%醋酸的水溶液浸泡1 h洗脫多余染色劑,最后使用凝膠成像儀拍照。

1.2.10 乳化性能的測定 參考李學(xué)鵬等[31]的方法并稍作調(diào)整。用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至1 mg/mL。將大豆油分散在MP懸浮液(v∶v=1∶4)中制備水包油乳劑25 mL,置入相同的塑料離心管(直徑2.5 cm)內(nèi)。乳劑在室溫下以10000 r/min均質(zhì)1 min,從離心管底部5 mm處取40 μL新制備的乳狀液,分散于4 mL 0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中。乳液在室溫下靜置10 min后在500 nm處測定吸光度,并記錄為A0。以0.1% SDS溶液做空白。10 min后在離心管相同位置再次進行上述處理,吸光度值記作A10。乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別表示為EAI(m2/g)和ESI(%)。

式中,A500表示在500 nm處的吸光度;ρ表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;φ表示乳化液的油體積分數(shù)(v/v)；2、2.303為固定常數(shù)。

式中,A10和A0分別表示在500 nm處0 min和靜置10 min后時的吸光度。

1.2.11 熱凝膠的制備與測定

1.2.11.1 熱凝膠的制備 參考Xia等[36]的方法,并稍有修改。用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至30 mg/mL。取5 g MP溶液放入平底西林瓶(直徑22 mm,高50 mm)中,并在20 ℃時放入恒速升溫水浴鍋中以1.2 ℃/min的增量加熱至75 ℃,保持10 min后停止加熱并立即在冰浴冷卻1 h,并在4 ℃冰箱中保存過夜,制得蛋白凝膠。

1.2.11.2 凝膠的質(zhì)構(gòu)分析 參考Xiong等[28]的方法,使用質(zhì)構(gòu)儀對樣品進行質(zhì)構(gòu)分析。凝膠在冰箱中4 ℃固化過夜后,除去表面液體,在25 ℃水浴中平衡凝膠樣品1 h。探針類型選擇P/0.5。預(yù)速度、測試速度和后速度分別設(shè)置為1.0、0.5和1.0 mm/s。測量距離為5.0 mm,觸發(fā)力為5 g,觸發(fā)方式為自動。數(shù)據(jù)采集時間為200 pps。最后表示為硬度、彈力、凝聚力和咀嚼性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行三次操作,數(shù)據(jù)以平均值±標準差(SD)表示。采用Origin 8.0軟件分析并作圖,SPSS軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。平均值之間在P<0.05時差異顯著。所有樣品均至少設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AAPH濃度對兔肉MP中羰基含量的影響

圖1為ROO· 氧化體系中AAPH濃度對兔肉MP羰基含量的影響。對照組的羰基含量為0.85 nmol/mg,在37 ℃反應(yīng)24 h,AAPH濃度為0 mmol/L的樣品組的羰基含量與對照組無顯著差異。而隨著AAPH濃度的增加,MP羰基含量逐漸增加,在10 mmol/L AAPH處理下羰基含量高達3.44 nmol/mg。其中,AAPH濃度為2.5 mmol/L的處理組較1.0 mmol/L的處理組羰基含量顯著升高(P<0.05),而濃度繼續(xù)升高時羰基含量增加緩慢,說明2.5 mmol/L AAPH可高效引起MP氧化羰基化。蛋白質(zhì)羰基含量是評判蛋白質(zhì)氧化程度的敏感性指標[37]。丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)氧化的副產(chǎn)物也能促進家兔MP的羰基化[38]。羰基是蛋白發(fā)生氧化的標志性產(chǎn)物,結(jié)果顯示,兔肉MP的氧化程度隨AAPH濃度增加而升高。羰基含量的增加可能與賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等氨基酸的側(cè)鏈易被氧化形成羰基衍生物有關(guān)[39],此外,氧化引起的肽鏈斷裂也會引起羰基增加[40]。本實驗結(jié)果表明,ROO·自由基可以引起兔肉MP中羰基含量顯著增加(P<0.05),促進蛋白氧化反應(yīng)的發(fā)生。

圖1 AAPH濃度對兔肉MP中羰基含量的影響

2.2 AAPH濃度對兔肉MP中游離巰基含量的影響

肌球蛋白和肌動蛋白是MP中含量最高的2種蛋白質(zhì),肌球蛋白分子中約含有42個巰基,肌動蛋白分子中約含有12個巰基[41]。蛋白氧化可導(dǎo)致一些敏感性含硫氨基酸,如半胱氨酸、蛋氨酸等中的游離巰基被氧化成二硫鍵,造成巰基含量減少,因此,巰基含量可作為檢測蛋白質(zhì)氧化程度的指標。

圖2顯示了ROO·氧化體系中AAPH濃度對兔肉MP游離巰基含量的影響,對照組的游離巰基含量為55.52 nmol/mg,隨著AAPH濃度的升高,游離SH含量顯著降低(P<0.05),10 mmol/L AAPH處理組游離巰基含量降至4.26 nmoL/mg。巰基含量的變化主要源于兩個方面:敏感性含硫氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸)的游離巰基受自由基攻擊后會被氧化形成二硫鍵,使MP巰基含量減少;氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展,從而使臨近的游離巰基相互交聯(lián)形成二硫鍵[6]。Zhou等[42]研究豬肉MP氧化情況時,發(fā)現(xiàn)隨著AAPH濃度增大,MP中游離巰基下降,而二硫鍵含量升高,推測MP氧化引起蛋白斷裂或聚集等結(jié)構(gòu)方面的改變使游離巰基間距縮小,游離巰基形成了二硫鍵交聯(lián)。本研究中兔肉羰基含量和游離巰基含量的變化說明了AAPH熱分解產(chǎn)生ROO·的氧化體系可引起兔肉MP中側(cè)鏈氨基酸的氧化,從而使MP發(fā)生氧化修飾,且隨著AAPH濃度增大,MP氧化程度越大。

圖2 AAPH濃度對MP中游離巰基含量的影響

2.3 AAPH濃度對MP中二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸易受活性氧自由基氧化攻擊,屬于敏感型氨基酸。在蛋白氧化過程中會產(chǎn)生越來越多的酪氨酸自由基和酪氨酸殘基,相互結(jié)合形成二聚酪氨酸[32]。二聚酪氨酸含量可用相對熒光值(AU)來表示[43]。本研究發(fā)現(xiàn),在氧化體系中,二聚酪氨酸含量變化類似于羰基含量,相較于對照組,高濃度的AAPH(10.0 mmol/L)可以導(dǎo)致二聚酪氨酸含量的顯著增加(P<0.05)。這與Chen等[43]及崔文斌[44]發(fā)現(xiàn)的氧化強度增加可顯著提升肉蛋白中二聚酪氨酸含量的研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果說明,酪氨酸殘基對ROO·自由基也很敏感,易在ROO·自由基攻擊下發(fā)生交聯(lián)聚合形成二聚酪氨酸,這也進一步說明ROO·自由基氧化體系可影響MP結(jié)構(gòu)。

圖3 AAPH濃度對兔肉MP中二聚酪氨酸含量的影響

2.4 AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響

圖4顯示了AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響,對照組的表面疏水性最弱,隨著AAPH濃度的增加(0～0.2 mmol/L),兔肉MP的表面疏水性顯著增強(P<0.05),這很可能是由于蛋白質(zhì)氧化引起的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)展開,疏水性基團暴露增加從而表現(xiàn)出疏水性的上升[30,45]。AAPH濃度為0.2～2.5 mmol/L時,表面疏水性隨AAPH濃度增加有所減弱但變化不顯著(P>0.05)。這可能是由于MP表面的疏水性基團通過疏水相互作用聚集使得表面疏水性降低,氧化引起MP結(jié)構(gòu)的裂解和聚集是同時發(fā)生的,但這一時期的聚集強度稍強[46]。進一步提高AAPH濃度后(2.5～10.0 mmol/L),MP表面疏水性再次增加,可能是當(dāng)氧化太劇烈時,聚合的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,非極性氨基酸再度暴露于蛋白質(zhì)外表面,表面疏水性再次增強。本研究結(jié)果表明,氧化可以改變MP的構(gòu)象結(jié)構(gòu),從而影響其表面疏水性[47]。

圖4 AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響

2.5 AAPH濃度對兔肉MP內(nèi)源性熒光的影響

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有熒光性,蛋白質(zhì)熒光光譜的變化可以用于反映和監(jiān)測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化,色氨酸熒光法已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)三級構(gòu)象變化的檢測[48-49]。在圖5中可以發(fā)現(xiàn),隨著AAPH濃度的增加,蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強度逐漸降低,表明在氧化過程中蛋白質(zhì)顯色氨基酸的顯色基團位置發(fā)生改變或遭到破壞。方海硯等[50]也觀察到羥自由基氧化體系中MP內(nèi)源熒光強度隨著H2O2濃度的增大而逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,經(jīng)24 h 37 ℃保溫處理后,無添加AAPH的樣品熒光強度明顯降低,但在羰基和游離巰基的含量變化上兩組差異不顯著,說明熱處理對兔肉MP熒光強度有影響,而對羰基含量和巰基含量無影響。

圖5 AAPH濃度對兔肉MP內(nèi)源性熒光的影響

2.6 AAPH濃度對兔肉MP粒徑的影響

MP平均粒徑的變化可以反映蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集或破碎的狀態(tài)。如圖6所示,隨著AAPH濃度的增加,蛋白粒徑逐漸增大,當(dāng)AAPH濃度為5.0 mmol/L時,粒徑達到最大值,為4200 nm。而當(dāng)AAPH濃度持續(xù)增加到10.0 mmol/L時,粒徑減小到2670 nm。這說明一定濃度范圍(AAPH 0～5.0 mmol/L)內(nèi),ROO·氧化體系引起的蛋白氧化有利于粒徑小的蛋白發(fā)生分子間聚集,使蛋白粒徑增加;而當(dāng)MP被過度氧化,則會導(dǎo)致肽鏈斷裂,從而使蛋白粒徑降低。周麟依等[51]研究也發(fā)現(xiàn)0～10 mmol/L的MDA處理條件下,MDA濃度越高蛋白粒徑越大。

圖6 AAPH濃度對兔肉MP粒徑的影響

2.7 AAPH濃度對兔肉MP凝膠電泳圖譜的影響

目前,測定蛋白裂解、交聯(lián)程度常用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE),根據(jù)電泳圖譜上不同樣品條帶間的差異可判斷蛋白質(zhì)是否存在裂解或交聯(lián)聚合反應(yīng)[52]。如圖7所示,兔肉MP分子量分布主要集中在100～245和35～48 kDa范圍內(nèi),從對照組到添加1.0 mmol/L AAPH的處理組,隨著AAPH濃度的增加,肌球蛋白重鏈(Myosin HC,210 kDa)、肌動蛋白(Actin,42 kDa)和肌球蛋白輕鏈(Myosin LC,15～24 kDa范圍)的電泳條帶強度明顯降低,而在100～180 kDa范圍內(nèi)出現(xiàn)新的條帶,且條帶隨AAPH的增加而變清晰,這可能是分子量大于180 kDa的蛋白質(zhì)輕度氧化而降解以及小分子量蛋白發(fā)生交聯(lián)的共同結(jié)果。當(dāng)AAPH濃度達到10.0 mmol/L時,所有條帶明顯減弱,幾乎完全消失,這表明劇烈氧化造成了蛋白質(zhì)發(fā)生了降解。由此可知,在AAPH熱分解產(chǎn)生ROO·氧化體系中,兔肉MP在低氧化濃度下可同時發(fā)生小分子量蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集和大分子量降解,而在高氧化濃度下則以蛋白質(zhì)降解為主,這與Zhang等[30]的研究結(jié)果相似。

圖7 AAPH濃度對兔肉MP SDS-PAGE圖譜的影響

2.8 AAPH濃度對兔肉MP乳化性的影響

乳化作用是將兩種互不相溶的液體均勻的混合在一起的作用,乳化性是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)之一[53]。蛋白乳化性可影響肉品的彈性、嫩度、保水性等性能,是肉蛋白的重要功能性質(zhì)之一。乳化性可以通過乳化活性和乳化穩(wěn)定性來表達,乳化活性反映了在乳液形成過程中,蛋白質(zhì)在油/水界面的吸附能力[54],乳化穩(wěn)定性是指防止相分離(抵抗乳狀分層、絮凝和沉淀等分離現(xiàn)象)維持乳狀液穩(wěn)定的能力[16]。

由圖8和圖9可知,隨著AAPH濃度增大,兔肉MP的乳化活性逐漸上升,而乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢,但均僅在AAPH濃度較大時與對照組有顯著差異(P<0.05,乳化活性中AAPH濃度≥2.5 mmol/L,乳化穩(wěn)定性中AAPH濃度≥5.0 mmol/L),說明較強的氧化具有顯著改變兔肉MP乳化活性及乳化穩(wěn)定性的效果。這可能是因為蛋白經(jīng)過氧化,結(jié)構(gòu)伸展,展露出更多的親油基團和親水基團,能夠較好地交聯(lián)油相和水相,因此乳化活性上升;同時,蛋白質(zhì)不斷地聚集和變性,連續(xù)相中沒有足夠的蛋白質(zhì)來完全包裹住脂肪滴,乳濁液分層加快,表現(xiàn)出乳化穩(wěn)定性下降的趨勢。

圖8 AAPH濃度對兔肉MP乳化活性的影響

圖9 AAPH濃度對兔肉MP乳化穩(wěn)定性的影響

2.9 AAPH濃度對兔肉MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

熱加工條件直接影響著MP熱誘導(dǎo)形成凝膠的質(zhì)地,與肉品的組織結(jié)構(gòu)、外觀和持水性等密切相關(guān),影響肉品的經(jīng)濟效益。兔肉MP熱制凝膠的質(zhì)構(gòu)特性如凝膠硬度(g)、彈力(mm)、凝聚力及咀嚼性(N×mm)的變化分別如圖10所示,凝膠的四項質(zhì)構(gòu)指標均隨著AAPH添加量的增加先升高后下降,并在1.0 mmol/L達到最高,可見輕度氧化能夠改善兔肉MP凝膠的硬度等特性[55],而過度氧化可導(dǎo)致凝膠的彈性、凝聚力等性質(zhì)變差[42,56]。有研究顯示,由羥基自由基誘導(dǎo)的鳙魚MP的適度氧化可形成彈性良好的凝膠網(wǎng)絡(luò),提高蛋白質(zhì)凝膠的質(zhì)地和保水力[57]。Zhou等[42]研究發(fā)現(xiàn)高濃度AAPH引起的肌球蛋白降解會導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)變差。二硫鍵和非二硫共價鍵是形成MP凝膠體系的關(guān)鍵,而離子鍵與氫鍵不是維持凝膠穩(wěn)定構(gòu)象的主要化學(xué)作用力[58],非二硫共價鍵為熱誘導(dǎo)凝膠中主要的化學(xué)作用力,氧化程度過高可破壞非二硫共價鍵使得凝膠強度降低[59]。

圖10 AAPH濃度對兔肉MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

2.10 相關(guān)性分析

由表1可知,游離巰基與二聚酪氨酸(r=-0.950)、羰基含量(r=-0.968)、乳化活性(r=-0.981)、蛋白粒徑(r=-0.867)均呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)(P<0.01),與內(nèi)源性熒光(r=0.944)、乳化穩(wěn)定性(r=0.880)極顯著正相關(guān)(P<0.01);羰基含量與二聚酪氨酸(r=0.951)、乳化活性(r=0.975)、蛋白粒徑(r=0.798)呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與內(nèi)源性熒光(r=-0.931)、乳化穩(wěn)定性(r=-0.919)極顯著負相關(guān)(P<0.01),可以看出,各蛋白氧化指標之間均有一定的相關(guān)性,其中部分指標之間有極強的相關(guān)性,說明在蛋白氧化過程中,多種物理化學(xué)反應(yīng)同時在發(fā)生,并相互影響。硬度與彈力、咀嚼性、凝聚力這幾項物性指標相互之間均有極顯著的正相關(guān)性(P<0.01),表明隨氧化的進行,蛋白凝膠的物理特性變化方向一致。

表1 各指標相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本研究采用不同濃度AAPH形成的烷過氧自由基對兔肉MP進行氧化,以探討不同氧化程度對兔肉MP的影響。隨著AAPH濃度的升高,蛋白的游離巰基含量、內(nèi)源性熒光強度、蛋白乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢,而羰基含量、二聚酪氨酸含量、蛋白粒徑則呈上升趨勢,表明AAPH形成的烷過氧自由基模擬氧化體系能夠?qū)ν萌釳P產(chǎn)生明顯地氧化作用,且隨著AAPH濃度升高兔肉MP氧化程度加劇,引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)型發(fā)生改變,蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)程度上升,疏水基團遷移,導(dǎo)致MP表面疏水性和粒徑發(fā)生了變化,也使蛋白質(zhì)的乳化活性逐漸增強而乳化穩(wěn)定性逐步降低。熱誘導(dǎo)凝膠強度和SDS-PAGE結(jié)果進一步表明,適度氧化導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)的松弛和斷裂有助于促進凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成,改善蛋白質(zhì)凝膠的結(jié)構(gòu);而過度氧化會嚴重破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),削弱其凝膠形成能力和熱誘導(dǎo)凝膠強度,導(dǎo)致凝膠硬度、彈力、凝聚力、咀嚼性等性質(zhì)變差。由此可見,MP氧化能夠明顯改變兔肉蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),在實際生產(chǎn)中能夠?qū)ν萌獾娜馄菲焚|(zhì)產(chǎn)生影響。因此,兔肉在后續(xù)生產(chǎn)加工中應(yīng)控制蛋白氧化程度以保障肉品品質(zhì)。

后續(xù)可進行人體胃腸消化模擬,研究兔肉MP氧化后體外消化特性的變化,探究氧化對兔肉MP體外消化特性的影響,進一步對兔肉制品的生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。