動(dòng)力學(xué)法優(yōu)化堿性果膠酶比活的測(cè)定方法

邢明霞,王鵬博,許文廷,張鳳國(guó),呂興霜,陳相玉,鄔雅喃,詹志春,張永勤,*

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院,山東青島 266042;2.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司,湖北武漢 430070)

果膠存在于植物細(xì)胞壁中,是由α-1,4鏈接的D-半乳吡喃糖醛酸單元構(gòu)成的一種雜多糖,其上含有不同甲酯化度的羧基基團(tuán)和鼠李半乳糖醛酸聚糖[1-2]。果膠酶廣泛應(yīng)用于飼料[3-5]、食品[6-10]、醫(yī)藥[11-13]、造紙[14-15]、紡織[16-17]等行業(yè)。酶活力是果膠酶的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo),對(duì)于其生產(chǎn)、應(yīng)用和研發(fā)具有重要意義。而酶的比活力(簡(jiǎn)稱為比活)為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所具有的酶活力,是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。比活力的測(cè)定涵蓋蛋白質(zhì)濃度和酶活力兩個(gè)技術(shù)指標(biāo)。

在蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法中,Lowrry法的靈敏度最高,紫外法操作最簡(jiǎn)單。工業(yè)領(lǐng)域所需測(cè)定的果膠酶制劑往往并非純酶制劑,其中所含有的非蛋白物質(zhì)難免會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾,因此,紫外法很難滿足測(cè)定要求,而高靈敏度的Lowrry法是在高倍稀釋度的條件下測(cè)定蛋白濃度,盡可能免去了雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾,因而成為首選測(cè)定方法。然而,由于該方法中的牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線往往不過原點(diǎn)[18],致使果膠酶蛋白濃度在測(cè)定中因稀釋倍數(shù)不同而不同,由此給測(cè)定工作帶來(lái)極大困擾。

堿性果膠酶活力的測(cè)定方法有粘度法、脫膠作用時(shí)間法[19]、滴定法[20-21]、pH比色法[22]、二硝基水楊酸(DNS)比色法[23-24]、甲醇釋放法和紫外法[25]等,其中粘度法和甲醇釋放法已被廢除,目前最常采用的方法為DNS法,但該法仍存在靈敏度較低、果膠降解產(chǎn)物非化學(xué)計(jì)量等問題[26-29]。對(duì)于堿性果膠酶,常使用測(cè)定果膠裂解酶活性的紫外法,因裂解發(fā)生在堿性條件下,且該法無(wú)需顯色反應(yīng),產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。該酶以反式消去方式作用于α-1,4-糖苷鍵,在半乳糖醛酸非還原末端形成C4和C5不飽和鍵,通過測(cè)定該不飽和鍵的光吸收即可計(jì)算酶活力測(cè)定值[25]。在酶活力測(cè)定的終點(diǎn)法中,保持酶解進(jìn)程處于零級(jí)反應(yīng)狀態(tài)對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定酶活力至關(guān)重要。然而,相關(guān)動(dòng)力學(xué)研究迄今未見報(bào)道。

因此,本文在建立準(zhǔn)確的果膠酶蛋白測(cè)定方法的基礎(chǔ)上,擬以動(dòng)力學(xué)測(cè)定法從底物、鈣離子激活劑、pH、底物濃度等因素考察堿性果膠酶的酶解進(jìn)程,并探尋其最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng),以期確證酶活力測(cè)定終點(diǎn)法的合理性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性果膠堿性果膠酶(2.13 kU/mL,QB/T 4482-2013) 武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司;牛血清白蛋白、聚半乳糖醛酸(P3339)、果膠(P9135,甲酯化度為7.7%) Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS)、苯酚、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、硫酸鋰、鉬酸鈉、鎢酸鈉、溴水、磷酸、鹽酸、氯化鈣、硫酸銅等 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

pH計(jì)(FE20)、AL204電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;HZ-82A恒溫振蕩器 上海易友儀器有限公司;UV2600紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;Vortex 1圓周振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白濃度的測(cè)定 參照張龍翔等[30]的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定酶蛋白濃度。將0.4 mL牛血清白蛋白溶液與Folin甲液2 mL充分混勻,靜置10 min后加入0.2 mL Folin乙液,充分混勻并靜置30 min后測(cè)其吸光度值,實(shí)驗(yàn)溫度為室溫(25 ℃)。

1.2.2 酶活力測(cè)定方法

1.2.2.1 終點(diǎn)法 取0.1 mL酶液加入2 mL 2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液37 ℃ 酶解15 min后加入3 mL磷酸終止液終止酶解反應(yīng),充分混勻,在200～300 nm處測(cè)定吸光度值。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組類似,只是0.1 mL酶液在加入3 mL磷酸終止液之后補(bǔ)加。

1.2.2.2 動(dòng)力學(xué)法 取聚半乳糖醛酸溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預(yù)熱10 min后,加1 mL堿性果膠酶起始酶解反應(yīng),分別于20 s、10、20、30、40、50、60 min從錐形瓶中吸取2.1 mL酶解液迅速加入到盛有3 mL磷酸終止液的試管中混勻,以終止酶解反應(yīng),在200～300 nm處測(cè)定吸光度值。

該酶活力單位可被定義為在最佳酶解條件下,每分鐘使每毫升酶解液的吸光度值增加0.001的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3 氯化鈣對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響 在緩沖溶液中加入氯化鈣,配制成含0.44 mmol/L氯化鈣的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液,分別用含氯化鈣緩沖溶液和不含氯化鈣緩沖溶液配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液和梯度酶溶液酶溶液(0～4.36 μg/mL),參照1.2.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 底物對(duì)酶活力測(cè)定的影響 用pH9 0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液配制梯度酶溶液(0～4.36 μg/mL),用緩沖溶液分別配制2 mg/mL聚半乳糖醛酸和2 mg/mL果膠溶液作為底物溶液,參照1.2.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 pH對(duì)酶活力測(cè)定的影響 各取pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預(yù)熱一段時(shí)間。參照1.2.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響 各取濃度不同的聚半乳糖醛酸溶液(0、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.7、1、2、3 mg/mL)20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預(yù)熱一段時(shí)間,加1 mL 0.436 μg/mL堿性果膠酶起始酶解反應(yīng),參照1.2.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響 取2 mg/mL聚半乳糖醛酸溶液溶液20 mL于錐形瓶中,蓋上保鮮膜,放入37 ℃恒溫振蕩器預(yù)熱一段時(shí)間。加1 mL梯度稀釋的堿性果膠酶液(0～1.43 μg/mL)起始酶解反應(yīng),混合后酶解液中酶濃度為0～0.071 μg/mL,參照1.2.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 檢測(cè)限(LOD)的測(cè)定 用最適pH配制的緩沖溶液代替果膠酶液,參照1.2.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定。其中,LOD的計(jì)算公式如下:

LOD=t(n-1,0.99)×S/Slope

式(1)

式中,S為酶濃度為0的0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液根據(jù)1.2.2的方法所測(cè)得的空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差,樣本數(shù)(n)為10;Slope為酶解30 min所測(cè)得的酶解產(chǎn)物的吸光度值;t(n-1,0.99)=2.821。

1.2.9 DNS法測(cè)定果膠酶活力

1.2.9.1 還原糖的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取具有一定濃度梯度(0～1 mg/mL)的半乳糖醛酸溶液0.4 mL于試管中,加入0.3 mL DNS試劑[30],混勻,在沸水浴中加熱10 min,立即用冷水冷卻至室溫,加4.3 mL水,混勻,在490 nm處測(cè)吸光度值,根據(jù)每組半乳糖醛酸濃度與反應(yīng)后不同時(shí)間測(cè)得的半乳糖醛酸吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線。

1.2.9.2 酶活力測(cè)定法及DNS法酶活力單位定義 取4 mL 7 mg/mL的果膠于錐形瓶,放入37 ℃恒溫振蕩器預(yù)熱一段時(shí)間預(yù)熱,加入4 mL 0.349 μg/mL果膠酶液迅速混勻以起始酶解反應(yīng),分別于20 s、10、20、30、40、50、60 min從錐形瓶中吸取0.4 mL酶解液,迅速加入到盛有0.3 mL DNS的試管中混勻,以終止酶解反應(yīng),參照1.2.9.1的方法進(jìn)行還原糖測(cè)定,以20 s時(shí)的酶解液為空白,根據(jù)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算每個(gè)時(shí)間段內(nèi)還原糖的增加量。果膠酶的活力單位可被定義為在上述條件下,每毫升反應(yīng)液中,每分鐘產(chǎn)生1 μmol/mL相當(dāng)于半乳糖醛酸的量為一個(gè)酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行圖表及數(shù)據(jù)處理,并計(jì)算每個(gè)波長(zhǎng)下的斜率(Slope)、線性決定系數(shù)(R2)和截距(Intercept)、檢測(cè)限(LOD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以及空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S)的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白濃度測(cè)定方法優(yōu)化與果膠酶蛋白濃度的測(cè)定

本文采用靈敏度較高的Lowrry法測(cè)蛋白濃度,為了探求最佳顯色波長(zhǎng),以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并以相同的方法測(cè)定果膠酶蛋白濃度,待顯色后在450～700 nm波長(zhǎng)范圍下進(jìn)行光譜掃描以獲得該波長(zhǎng)下吸光度值,計(jì)算每一波長(zhǎng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和R2,并對(duì)波長(zhǎng)作圖,結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率隨波長(zhǎng)增大而增大的同時(shí),其空白值也隨之增大(如圖1a)。當(dāng)波長(zhǎng)大于550 nm時(shí),如常規(guī)采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為750 nm[18]、640 nm[31]等,則導(dǎo)致其線性決定系數(shù)R2隨之下降,截距明顯增加,如圖1b所示,果膠酶蛋白的濃度回歸曲線與BSA的結(jié)果相似。因此,為避開空白值對(duì)測(cè)定的干擾,550 nm是最佳測(cè)定波長(zhǎng),其R2最大,截距最小。該波長(zhǎng)下測(cè)得BSA蛋白濃度曲線如圖1c所示,為避免稀釋倍數(shù)不同而導(dǎo)致的測(cè)定值差異,特將BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線和果膠酶蛋白濃度回歸曲線逼過原點(diǎn),則其線性方程分別為y=0.5223x(R2=0.9978)、y=0.1198x(R2=0.9955),將果膠酶蛋白所測(cè)吸光度值帶入前者公式中即可獲得果膠酶蛋白濃度測(cè)定值,并根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得果膠酶蛋白原液的濃度為4.36 mg/mL。

圖1 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及果膠酶蛋白測(cè)定的影響

2.2 氯化鈣對(duì)酶測(cè)定的影響

鈣離子有利于促進(jìn)果膠酶發(fā)揮裂解作用,對(duì)果膠酶有激活作用[32],因此有必要考察其對(duì)酶活力測(cè)定的影響。圖2為酶蛋白濃度在0～4.36 μg/mL時(shí)酶解30 min的酶蛋白濃度回歸曲線,其中氯化鈣濃度為0.44 mmol/L。結(jié)果表明,鈣離子可提高酶解活力至2倍以上,且其酶濃度回歸曲線的截距更接近原點(diǎn),更有利于果膠酶活力的測(cè)定與計(jì)算。

圖2 氯化鈣對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響

2.3 底物對(duì)酶活力測(cè)定的影響

酶活力測(cè)定成本絕大部分取決于果膠酶解底物,因此,選擇專一性底物并在較低濃度下進(jìn)行酶活力測(cè)定是降低檢測(cè)成本的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)分別以果膠和果膠的主鏈結(jié)構(gòu)聚半乳糖醛酸為底物,考察在上述優(yōu)化條件下,該果膠酶在不同蛋白濃度(0～4.36 μg/mL)條件下的酶活力,其中,底物濃度為2 mg/mL,pH為9。結(jié)果表明,以聚半乳糖醛酸為底物可獲得更高酶活力,是以果膠底物的1.62倍,如圖3所示。可能原因?yàn)楣z酶優(yōu)先對(duì)甲酯含量低的果膠酸作用,實(shí)驗(yàn)中果膠甲酯含量較高,導(dǎo)致酶的分解速率降低。

圖3 底物對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響

2.4 pH對(duì)酶活力測(cè)定的影響

在最適pH條件下測(cè)定其活力,才能體現(xiàn)酶制劑的最大價(jià)值。因此利用不同pH(7.5、8、8.5、8.8、9、9.2、9.5、10)的0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液配制成2 mg/mL的聚半乳糖醛酸溶液,并根據(jù)1.2.2.2的方法,通過動(dòng)力學(xué)酶解進(jìn)程曲線以優(yōu)化酶解pH。其中,果膠酶蛋白濃度為0.436 μg/mL,即,將原酶液稀釋十萬(wàn)倍。結(jié)果表明,在200～300 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi),在pH9.5時(shí)顯示最大酶解速率(即單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成速率),如圖4a所示,該結(jié)果在圖4b中,在232 nm波長(zhǎng)下不同pH條件下的酶解速率比較中得以進(jìn)一步證實(shí)。在pH9.5,檢測(cè)波長(zhǎng)為232 nm條件下,各酶蛋白濃度的酶解進(jìn)程曲線均顯示為零級(jí)反應(yīng),如圖4c所示。這說(shuō)明在pH9.5條件下的以終點(diǎn)法測(cè)定酶活力是切實(shí)可行的。

圖4 pH對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響

圖5 底物質(zhì)量濃度對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響

2.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響

圖5為按照方法1.2.2所做的不同底物質(zhì)量濃度(初始濃度為0～3 mg/mL)條件下的酶解進(jìn)程曲線,其中酶濃度為0.436 μg/mL。由該圖5可看出,底物濃度在低于1 mg/mL時(shí)對(duì)酶解速率影響明顯;在2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值,酶解產(chǎn)物隨時(shí)間呈線性增長(zhǎng),即處于零級(jí)反應(yīng)狀態(tài);在3 mg/mL時(shí),酶解速率已開始下降,可能的原因是,較高黏度會(huì)減小傳質(zhì)速率,影響酶促反應(yīng)進(jìn)程,因此2 mg/mL作為測(cè)定酶活力時(shí)的最佳底物質(zhì)量濃度(初始濃度)。此外,由動(dòng)力學(xué)曲線可知,在較低底物質(zhì)量濃度(≤0.7 mg/mL)條件下,其反應(yīng)進(jìn)程均非零級(jí)反應(yīng),即便通過酶解10 min的產(chǎn)物濃度(吸光度值)也無(wú)法得到準(zhǔn)確的Km值,顯然,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于Km值的測(cè)定至關(guān)重要,僅用系數(shù)校正可能不能滿足Km值測(cè)定的要求。

2.6 酶濃度對(duì)酶活力測(cè)定的影響

在上述優(yōu)化的酶活力測(cè)定條件下,按照1.2.2.2的動(dòng)力學(xué)法考查酶質(zhì)量濃度對(duì)酶解進(jìn)程的影響。如圖6a所示為不同酶終濃度范圍下,檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)酶解速率的影響,由圖6a可知在232 nm波長(zhǎng)下得到最大酶解速率;由圖6b可知,在220～245 nm波長(zhǎng)區(qū)域下,酶解速率與酶質(zhì)量濃度具有良好線性關(guān)系,以酶解30 min為例,其LOD值在232～240 nm也保持較低水平;然而,檢測(cè)波長(zhǎng)越大,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)會(huì)隨之增大,說(shuō)明精密度會(huì)隨之降低(圖6c)。因此,綜合檢測(cè)靈敏度及精密度的結(jié)果,232 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖6 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)果膠酶活力測(cè)定的影響

在該檢測(cè)波長(zhǎng)下,所測(cè)得的各酶濃度條件下的酶解動(dòng)力學(xué)進(jìn)程曲線均顯示零級(jí)反應(yīng)狀態(tài),如圖7a所示,且酶質(zhì)量濃度與酶解速率呈良好線性(圖7b),其R2達(dá)0.9967,更為重要的是該曲線過原點(diǎn),避免了果膠酶制劑因稀釋倍數(shù)不同產(chǎn)生的測(cè)量誤差,而不過原點(diǎn)的問題在DNS法中普遍存在[23-24]。由酶動(dòng)力學(xué)曲線的零級(jí)反應(yīng)狀態(tài)可知,終點(diǎn)法測(cè)酶活力時(shí),吸光度值只要在0～2范圍內(nèi),酶解時(shí)間可以靈活掌握,而非拘泥于一個(gè)固定的時(shí)間段。以終點(diǎn)法酶解30 min為例,LOD值為0.0071 μg/mL,將該值帶入圖7b中的公式“y=0.0213x”,則LOD為0.15 mU/mL,本文所用堿性果膠酶制劑的比活可通過圖7b中的公式“y=0.6398x”計(jì)算并得出21.3 U/mg蛋白,該酶制劑蛋白含量已在2.1中求得為4.36 mg/mL,因此,該產(chǎn)品的酶活力為0.92 kU/mL。

圖7 果膠酶濃度動(dòng)力學(xué)曲線

2.7 DNS法測(cè)堿性果膠酶活力

根據(jù)圖8可以看出,DNS靈敏度很低,當(dāng)半乳糖醛酸濃度很低時(shí)難以檢測(cè)到,所以DNS測(cè)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線是不過原點(diǎn)的,所以利用DNS法測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力會(huì)出現(xiàn)較大的偏差。根據(jù)右圖可以看出,DNS法測(cè)酶活力時(shí),隨著酶解時(shí)間的增加,反應(yīng)不是零級(jí)反應(yīng),所以酶解時(shí)間會(huì)影響比活的測(cè)定,所以在利用終點(diǎn)法測(cè)酶活力時(shí),酶解時(shí)間不能靈活掌握,限制了酶活力測(cè)定。以終點(diǎn)法酶解30 min為例,計(jì)算并得出647 U/mg蛋白,該產(chǎn)品的酶活力為2.82 kU/mL。但是利用DNS測(cè)酶活力,在測(cè)定過程中,酶解速率隨酶解時(shí)間的增加不是呈直線增加,所以測(cè)定結(jié)果存在不準(zhǔn)確性。

圖8 DNS法測(cè)果膠酶活力曲線

3 結(jié)論

本文利用Folin-酚法來(lái)測(cè)果膠酶蛋白濃度,牛血清白蛋白和酶蛋白在450～700 nm下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)優(yōu)化果膠酶測(cè)定波長(zhǎng)為550 nm,在此波長(zhǎng)下計(jì)算得到酶蛋白為4.36 mg/mL;實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鈣離子可以作為果膠酶的激活劑,可以提高酶解活力;以果膠為底物的條件下酶解速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于以聚半乳糖醛酸為底物的酶解速率;實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)力學(xué)法在最優(yōu)測(cè)定條件下所測(cè)得果膠酶蛋白質(zhì)量濃度與酶解速率酶質(zhì)量酶解進(jìn)程曲線,在其吸光度值0～2范圍內(nèi)均處于零級(jí)反應(yīng)狀態(tài)。通過動(dòng)力學(xué)優(yōu)化酶的最佳pH為9.5,優(yōu)化底物濃度為2 mg/mL,最佳測(cè)定波長(zhǎng)為232 nm,在此波長(zhǎng)下通過酶解動(dòng)力學(xué),根據(jù)各酶濃度酶解速率的線性回歸方程得到LOD為0.15 mU,比活為21.3 U/mg蛋白,得到該產(chǎn)品的酶活力為0.92 kU/mL。通過酶動(dòng)力學(xué)曲線的零級(jí)反應(yīng)狀態(tài)可知,在利用終點(diǎn)法測(cè)酶活力時(shí),吸光度值只要在0～2范圍內(nèi),酶解時(shí)間可以靈活掌握,而非拘泥于一個(gè)固定的時(shí)間段。本文還與DNS法進(jìn)行對(duì)比,突出本實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和靈活性。