柏薏顆粒對高尿酸血癥大鼠的初步藥效學分析

張婷，尹哲，楊陽，吳振，王立強

(1. 華僑大學 醫(yī)學院，福建 泉州 362021; 2. 廈門大學 藥學院，福建 廈門 361102)

現代醫(yī)學認為在正常的嘌呤飲食情況下，非同日兩次空腹測定血尿酸水平，男性血尿酸水平高于420 μmol·L-1，女性高于360 μmol·L-1即稱為高尿酸血癥(HUA)[1].研究表明，高尿酸已成為冠心病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟、病急性心肌梗死等疾病的獨立危險因素[2-6].目前，我國HUA患病人數已超過1.2億，HUA成為繼高血壓、高血脂、高血糖之后的常見代謝性疾病[7].機體內尿酸水平的升高主要是由體內尿酸生成和排泄不平衡所致，而黃嘌呤氧化酶(XOD)是次黃嘌呤、黃嘌呤生成尿酸的關鍵限速酶，是研究降血尿酸機制的重要靶點[8].柏薏顆粒的基本處方來源于醫(yī)院制劑，用于治療高尿酸血癥、痛風性關節(jié)炎、痛風石等疾病.在原方的基礎上，加入萆薢、土茯苓、山慈菇、白芥子等藥材，具有清熱除濕、健脾補腎、降濁止痛、活血通絡等功效.原方為湯劑，其推廣和應用受到了限制.因此，本文在已完成柏薏顆粒處方及工藝研究的基礎上，建立HUA大鼠模型，探究柏薏顆粒降血尿酸的作用及機制.

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

柏薏顆粒(實驗室自制);非布司他(江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司);氧嗪酸鉀(深圳市博美生物科技有限公司);肌酐(Cr)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒、黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒、尿酸(SUA)試劑盒物(江蘇省南京建成生物工程研究所);二奎啉甲酸(BCA)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);有機陰離子轉運體1(OAT1)抗體(北京博奧森生物技術有限公司);葡萄糖轉運體9(GLUT9)抗體(武漢三鷹生物科技有限公司);蛋白磷酸酶抑制劑復合物(100×)、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE電泳液(10×)、ZD304型快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Western快速轉膜緩沖液(10×)30 min轉膜(電轉液)、彩色預染蛋白質中分子量標準(1～180 kDa)、脫脂奶粉(北京莊盟國際生物基因科技有限公司);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(安徽省合肥市bioshap生物科技有限公司);特超敏ELC化學發(fā)光試劑盒(上海市碧云天生物科技有限公司);質量分數為10%的水合氯醛(上海源葉生物科技有限公司)；乙醚(北京益利精細化學品有限公司)；羧甲基纖維素鈉(天津市福晨化學試劑廠)；無水乙醇(上海國藥集團).

1.2 實驗儀器

1200型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)、UV紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司)；BSA124S型電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-500E型超聲儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；渦旋儀(江蘇省海門其林貝爾公司)；5430R型低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)；InfiniteM200型多功能酶標儀(瑞士帝肯公司)；DYY-74型電泳儀(北京市六一儀器廠)；TS-1型搖床、JR92-IIDN型超聲波細胞破碎儀(浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司)；發(fā)光成像儀(北京市大龍儀器有限公司)；制冰機(江蘇省常熟市雪科電器公司)；超低溫冰箱(上海市賽默飛公司).

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量為(200±25) g(福建省閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司).

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

人體柏薏顆粒的每日用量為90 g，以成人體質量70 kg為基準，可換算出大鼠臨床等效劑量為8.10 g·kg-1，分別以等效劑量的4倍、2倍和1倍進行柏薏顆粒高(32.40 g·kg-1)、中(16.20 g·kg-1)和低(8.10 g·kg-1)劑量給藥.取8 g羧甲基纖維素鈉，加蒸餾水，加熱攪拌，溶解后定容至1 000 mL，獲得質量濃度為8 g·L-1的羧甲基纖維素鈉；稱取適量氧嗪酸鉀溶于羧甲基纖維素鈉溶液中，制得氧嗪酸鉀溶液，以300 mg·kg-1劑量給藥.稱取適量非布司他溶于羧甲基纖維素鈉溶液中，制得非布司他溶液，以3.6 mg·kg-1劑量給藥.

2.2 分組與造模

將72只雄性大鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、柏薏顆粒低劑量組(簡稱低劑量組)、柏薏顆粒中劑量組(簡稱中劑量組)、柏薏顆粒高劑量組(簡稱高劑量組)、非布司他陽性對照組(簡稱非布司他組).空白組灌胃給予生理鹽水，其余各組灌胃給藥OA溶液，建立HUA大鼠模型；連續(xù)造模7 d后，乙醚麻醉，尾靜脈取血檢測血尿酸值；確定造模成功后，開始治療給藥.除空白組和模型組給予相應體積的生理鹽水外，其余各組灌胃給予相應劑量的藥物.連續(xù)給藥14 d，每天給藥一次，每7 d稱量大鼠的體質量并觀察變化趨勢，同時,還需觀察大鼠的活動狀態(tài)、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、飲食及大小便情況.

2.3 尿酸濃度的測定

末次灌胃給藥后，禁食12 h，正常飲水，腹腔注射0.8 mL的水合氯醛(10 g·L-1)麻醉后，心臟取血，靜置2 h，于3 500 r·min-1離心10 min(4 ℃)，分離血清，測定血清中的尿酸濃度(c(SUA)).

2.4 肌酐和尿素氮濃度的測定

肌酐和尿素氮是腎小球濾過功能的重要指標，當腎小球受損時，濾過率降低，血清中的Cr，BUN濃度升高.使用Cr試劑盒與BUN試劑盒測定血清中的肌酐濃度(c(Cr))和尿素氮濃度(c(BUN)).

2.5 黃嘌呤氧化酶活性的測定

稱取1.0 g大鼠肝臟組織，按體質量(mg)∶體積(μL)=1∶10的比例，加入預冷生理鹽水，采用冰水浴，在低溫條件下進行機械勻漿，制備肝勻漿，于3 500 r·min-1離心10 min(4 ℃)，取上清液.使用XOD試劑盒測定黃嘌呤氧化酶活性.

2.6 OAT1及GLUT9蛋白表達的測定

稱取0.1 g腎臟組織，按體質量(mg)∶體積(μL)=1∶10的比例，加入組織蛋白(RIPA)裂解液及磷酸蛋白酶復合抑制劑混合液，將組織勻漿在冰上裂解30 min，提取組織蛋白，于3 500 r·min-1離心5 min(4 ℃)，取上清液，采用BCA法測定肝臟勻漿的蛋白濃度.用已知濃度的蛋白溶液稀釋上樣緩沖液(V(蛋白溶液)∶V(上樣緩沖液)=4∶1)，沸水浴條件下使蛋白變性.按照試劑盒的使用說明，配制電泳分離膠及濃縮膠，待膠凝固后，拔出梳子，以避免氣泡產生.按每孔30 μg上樣SDS-PAGE電泳，在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結束電泳.根據標準蛋白分子量位置，切下目的蛋白及內參相對應位置的電泳膠，采用濕轉法進行轉膜，轉膜后加入質量濃度為5 g·L-1的脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h；加入一抗溶液后置于搖床上，4 ℃下孵育過夜，用雜交膜(TBST)沖洗液洗膜3次，每次10 min；加入二抗溶液后置于搖床上，4 ℃下孵育8 h，用TBST沖洗液洗膜3次，每次10 min；加入化學發(fā)光試劑，在發(fā)光成像儀上顯影，用Image J軟件進行處理，分析膠片的上目標條帶的灰度值，觀察柏薏顆粒對OAT1和GLUT9蛋白表達的影響.

3 實驗結果

3.1 大鼠的體表狀態(tài)

經觀察發(fā)現大鼠的活動正常,精神狀況無明顯異常；毛發(fā)有光澤，外形無明顯變化；飲食正常，尿便未出現明顯異常現象.與空白組相比，模型組、柏薏顆粒低、中、高劑量組及非布司他組大鼠體質量的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明柏薏顆粒對大鼠的正常生長代謝沒有明顯影響.大鼠體質量的變化情況,如圖1所示.圖1中：m為大鼠的體質量.

3.2 柏薏顆粒對血清尿酸濃度的影響

不同組別的血清尿酸濃度，如圖2所示.圖2中：與空白組相比，“**”表示P<0.01；與模型組相比，“△△”表示P<0.01.由圖2可知：與空白組相比，模型組的血清尿酸濃度極顯著升高(P<0.01)，說明采用OA灌胃給藥法造模成功；與模型組相比，柏薏顆粒低、中、高劑量組的血清尿酸濃度均顯著下降(P<0.01)，說明柏薏顆粒具有降尿酸的作用，且隨著給藥劑量的增加，尿酸濃度逐漸下降，柏薏顆粒降尿酸作用呈劑量依賴性；高劑量組與非布司他組降尿酸效果明顯(P<0.01).

圖1 大鼠體質量的變化情況 圖2 不同組別的血清尿酸濃度Fig.1 Weight changes of rat Fig.2 Serum uric acid concentration in different groups

3.3 柏薏顆粒對血清肌酐和尿素氮濃度的影響

柏薏顆粒對血清肌酐濃度和尿素氮濃度的影響，分別如圖3，4所示.由圖3，4可知：各組肌酐濃度和尿素氮濃度之間的差異不顯著，說明柏薏顆粒對HUA模型大鼠具有明顯的腎臟保護作用，柏薏顆粒無腎損傷，適合長期服用.

圖3 柏薏顆粒對血清肌酐濃度的影響 圖4 柏薏顆粒對血清尿素氮濃度的影響Fig.3 Effect of Baiyi granules on serum creatinine concentration Fig.4 Effect of Baiyi granules on serum urea nitrogen concentration

3.4 柏薏顆粒對HUA大鼠肝臟中黃嘌呤氧化酶活性的影響

表1 HUA大鼠肝臟中的黃嘌呤氧化酶活性 Tab.1 XOD activity in HUA rat liver

3.5 柏薏顆粒對OAT1和GLUT9蛋白表達的影響

HUA大鼠腎臟勻漿中OAT1和GLUT9的蛋白條帶圖，如圖5所示.柏薏顆粒對OAT1和GLUT9蛋白表達的影響,分別如圖6，7所示.圖6,7中：與空白組相比，“**”表示P<0.01；與模型組相比，“△”表示P<0.05，“△△”表示P<0.01；k(OAT1)，k(GLUT9)分別表示OAT1，GLUT9蛋白相對表達水平.

由圖6，7可知：與模型組相比，柏薏顆粒高劑量組能顯著地降低腎臟GLUT9蛋白相對表達水平(P<0.05)，柏薏顆粒中、低劑量組也有降低GLUT9蛋白相對表達水平的作用，但無顯著差異，非布司他組極顯著降低腎臟GLUT9蛋白相對表達水平(P<0.01)；與模型組相比，柏薏顆粒高、中劑量組均能顯著上調腎臟OAT1蛋白表達水平，柏薏顆粒高劑量組上調OAT1蛋白表達的作用與非布司他組相當(P<0.01)，但柏薏顆粒低劑量組對OAT1作用的差異無統(tǒng)計學意義.這說明柏薏顆粒的降尿酸機制與抑制腎臟GLUT9蛋白的表達減少尿酸重吸收，以及上調OAT1蛋白表達促進尿酸的分泌有關.

(a) OAT1 (b) GLUT9圖5 免疫印跡法蛋白條帶圖Fig.5 Western blot protein band diagram

圖6 柏薏顆粒對OAT1蛋白表達的影響 圖7 柏薏顆粒對GLUT9蛋白表達的影響Fig.6 Effect of Baiyi granules on OAT1 protein expression Fig.7 Effects of Baiyi granules on GLUT9 protein expression

4 討論

目前，醫(yī)學上多采用西藥對HUA持續(xù)降酸治療，主要有別嘌醇、非布司他、丙磺舒、苯溴馬隆等.這些化學藥物雖然及時治療效果明顯，但臨床上長期服用都有較為明顯的不良反應，病情具有反復性，且患者依從性較差[9-11]，因此，亟需開發(fā)一種藥效持久、不良反應少的新藥物.根據中醫(yī)學理論，中醫(yī)藥在治療高尿酸血癥方面具有多成分、多靶點、多途徑、持久溫和、長期服用不良反應少等優(yōu)點.柏薏顆粒組方來源于國內醫(yī)院的臨床經驗方，可顯著降低大鼠SUA濃度，具有明顯的降尿酸作用.腎小球的濾過功能決定了血清中Cr的濃度，人體內蛋白質以BUN的形式代謝，產生最終末產物.各種腎病變均可使血液中Cr和BUN水平升高，而連續(xù)14 d服用柏薏顆粒，大鼠血清中的Cr和BUN濃度無明顯變化，表明柏薏顆粒對大鼠無腎損傷.后期可對柏薏顆粒進行急性毒性實驗考察，進一步驗證其安全性.

在高尿酸血癥的造模方法中，OA造模法最為常見，該法簡單易行且模型穩(wěn)定.OA為尿酸酶抑制劑，其結構與尿酸的嘌呤環(huán)相似，可競爭性地與尿酸酶結合，抑制體內尿酸的降解過程，能明顯升高大鼠體內血尿酸濃度，與人體內的嘌呤代謝過程相似.由于大鼠體內存在尿酸酶，可將體內尿酸進一步分解為尿囊素等物質排出體外.因此，建模成功后，隨著時間的延續(xù)，大鼠體內的尿酸濃度有降低的趨勢.

正常狀態(tài)下，人體內尿酸的生成和排泄基本上保持動態(tài)平衡.XOD是尿酸生成的關鍵酶，XOD活性升高或嘌呤代謝酶缺陷導致嘌呤利用障礙是尿酸水平升高的主要原因.研究表明，90%的原發(fā)性高尿酸血癥的病因與尿酸在腎臟的排泄減少有關[12].尿酸的排泄要經過腎小球濾過、近端小管重吸收、近端小管分泌及近端小管分泌后重吸收4個步驟[13]，涉及到多種尿酸轉運蛋白，主要分為尿酸重吸收蛋白(如尿酸陰離子轉運體1(URAT1)、GLUT9)，以及尿酸分泌蛋白(如有機陰離子轉運體(OATs)、尿酸轉運體(UAT)、多藥耐藥蛋白4(MRP4)等).大多數有機陰離子轉運蛋白(OAT)家族的成員是有機陰離子交換轉運體，其介導某種陰離子進入細胞的同時，釋放另一種陰離子到細胞外.OAT1介導細胞外有機陰離子與細胞內的α-酮戊二酸交換，能夠轉運尿酸.黃嘌呤、次黃嘌呤、皮質酮類激素和維生素鹽酸鹽等內源性化合物能夠抑制OAT1，減少尿酸分泌.GLUT9主要在人體肝、腎中表達，其轉運活性可能受胞內己糖濃度的影響，與URAT1協(xié)同完成對腎小管濾過的尿酸鹽的重吸收.腎臟表達的GLUT9介導尿酸重吸收，獨立于其他已知的尿酸轉運體，尋找有效的GLUT9抑制劑是促尿酸排泄的另一重要靶點[14-17].實驗結果表明，柏薏顆?？娠@著抑制GLUT9表達，并上調OAT1蛋白表達，表明其降尿酸機制可能與這兩個尿酸轉運體有關.后期實驗可增設柏薏顆粒對其他蛋白和因子的影響，以完善柏薏顆粒降尿酸的物質基礎.

由于柏薏顆粒由多味中藥材組成，因此，相較于化學藥物，柏薏顆粒的作用機制相對復雜，有的藥物能夠抑制尿酸的生成，有的藥物具有促進尿酸排泄的作用，有的藥材可協(xié)同保肝益腎，而各味藥材的具體作用機制及影響權重尚不明確，需進行進一步的研究.此外，高尿酸血癥病人在病情發(fā)作期常伴隨著紅腫熱痛等急性期癥狀，而本組方中加入了黃柏、蒼術、薏苡仁、川牛膝等多味可減輕炎癥反應的中藥材，可能對痛風急性期的紅腫熱痛也具有一定的治療效果，有待實驗進一步證實.