兒童非典型病原體肺炎病原及流行病學(xué)特征分析

王紫荊，方 劍，胡小林，侯曉華，謝屹峰，朱 靜，馬云馳，莊 琴

(成都兒童專科醫(yī)院內(nèi)科一病區(qū)，四川 成都 610015)

肺炎是住院兒童中常見的疾病，對(duì)兒童的生長發(fā)育和身心健康影響較大，給家庭和社會(huì)帶來十分沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。兒童肺炎可由多種呼吸道病原體感染引起，不同呼吸道病原體感染引起的肺炎臨床癥狀、體征相似，因此，臨床醫(yī)師僅僅依靠臨床癥狀、體征，很難對(duì)肺炎作出準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷[2]。如何早期確定兒童肺炎的病原體，對(duì)肺炎患兒進(jìn)行精準(zhǔn)的治療，一直是臨床醫(yī)師面臨的難題[3]。本研究采用多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法，對(duì)兒童肺炎常見13種呼吸道病原體進(jìn)行多重核酸檢測(cè)，旨在了解成都地區(qū)兒童非典型病原體肺炎的病原構(gòu)成和流行病學(xué)特征。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年3月至2020年2月成都兒童專科醫(yī)院收治的128例肺炎住院患兒，入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤14歲；②病程≤7天；(臨床癥狀體征及胸片檢查結(jié)果均符合肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(參照全國高等學(xué)校教材供基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防、口腔醫(yī)學(xué)類專業(yè)用《兒科學(xué)》第8版肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn))；④血常規(guī)+CRP檢測(cè)：WBC正?；蚪档?、CRP正?；蜉p度增高(CRP≤30 mg/L)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤28天；②痰培養(yǎng)、PCT等檢查提示細(xì)菌感染者。128例患兒中男79例，女49例，年齡(4.49±3.25)歲；<1歲組16例，1～3歲組28例，3～6歲組51例，≥6歲組33例。

1.2 方法儀器和試劑：全自動(dòng)核酸提取儀(由臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：Smart Lab Assistant SLA-32)、全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀(由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：ETC 811)、3500DX基因分析儀(由賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，型號(hào)：3500DX)、13項(xiàng)呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒(由寧波海爾施基因科技有限公司生產(chǎn))。咽拭子標(biāo)本的處置：將加有保存液的咽拭子標(biāo)本置于渦旋混勻儀上充分渦旋10秒鐘，以洗下咽拭子標(biāo)本上粘附的病原及含有病原的細(xì)胞。核酸提取：使用“核酸提取或純化試劑”(備案號(hào)：浙溫械備20150246號(hào))在自動(dòng)化提取工作站Smart LabAssist-16/32(備案號(hào)：國械備20140202)上進(jìn)行自動(dòng)核酸提取?；蛘呤褂谩昂怂崽崛』蚣兓噭?備案號(hào)：浙溫械備20150006號(hào))進(jìn)行手動(dòng)核酸提取。吸取相應(yīng)體積的樣本(包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照)并加入2 μl的RT-PCR內(nèi)參共同提取。RT-PCR多重?cái)U(kuò)增和毛細(xì)電泳分離檢測(cè)：在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中構(gòu)建多對(duì)引物，不同引物可與不同呼吸道病原的目的基因特異性結(jié)合。首先通過對(duì)13種呼吸道病原體的檢測(cè)靶點(diǎn)和3個(gè)內(nèi)參靶點(diǎn)進(jìn)行特異性的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)多重?cái)U(kuò)增，再采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測(cè)，從而得到相應(yīng)病原體的檢測(cè)結(jié)果。收集患兒的臨床資料，并記錄咽拭子多重核酸檢測(cè)結(jié)果。在患兒入院當(dāng)天采集咽拭子，采用多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法，檢測(cè)13種呼吸道非典型病原體的核酸(RNA類：甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠狀病毒；DNA類：腺病毒、博卡病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。各年齡組患兒病原檢出陽性率和多病原混合感染檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原檢出情況在128例標(biāo)本中，檢出至少1種病原的有78例，檢出陽性率60.94%。各年齡階段患兒病原檢出陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.51，P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡組肺炎患兒病原檢出陽性率比較

2.2 病原季節(jié)分布趨勢(shì)甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒存在季節(jié)流行特征，以冬春季節(jié)多見，其它病原無明顯季節(jié)性。

2.3 不同種類病原檢出情況128例患兒中，不同種類病原檢出率見圖1，其中檢出率居于前3位的病原依次是：肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒，偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒檢出率最低。各年齡組患兒中，不同病原檢出率見表2。

圖1 不同種類病原檢出率

表2 不同年齡組患兒病原檢出率 [n(%)]

2.4 多病原檢出情況在128例標(biāo)本中，同時(shí)檢出2種病原的有19例，混合感染檢出率14.84%。在各年齡階段患兒中，同時(shí)檢出2種病原檢出率比較見表3。在不同年齡組之間，混合感染檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 14.51，P< 0.05)，其中1～3歲組混合感染檢出率最高。沒有發(fā)現(xiàn)超過兩種病原混合感染的病例。

表3 不同年齡階段患兒中同時(shí)檢出2種病原檢出率比較

3 討論

在兒童非典型病原體肺炎中，多種病原體混合感染的現(xiàn)象日益增多，目前傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查方法包括：病原分離和培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等檢測(cè)方法。雖然病原的分離和培養(yǎng)是病原檢測(cè)最可靠的方法[4]，但是其培養(yǎng)條件要求苛刻、技術(shù)要求高、靈敏度低、耗時(shí)較長，不適合用于臨床早期診斷；免疫學(xué)法雖然是臨床常見的病原檢測(cè)方法，且操作簡單、快速，但易受患兒的病程、年齡等因素影響較大[5]，特異度和靈敏度低，可出現(xiàn)假陰性，臨床應(yīng)用受限；常規(guī)PCR法雖然具有快速、敏感度和特異度高，但檢測(cè)通量低，每次只能檢測(cè)一種病原體，可能會(huì)錯(cuò)過和延遲對(duì)復(fù)合感染的診斷和治療。故呼吸道病原多重核酸檢測(cè)技術(shù)就應(yīng)運(yùn)而生[6，7]，它是以普通PCR檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，進(jìn)一步發(fā)展演變而來的，可同時(shí)檢測(cè)多種病原體，不僅技術(shù)簡單、快速、準(zhǔn)確、高效，還可以提高樣本的使用效率[8～10]。

本組患兒結(jié)果顯示，兒童肺炎非典型病原體檢出陽性率較高，其中以肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒最為常見。在各年齡組患兒中，檢出率高的病原種類有所差異：在<1歲組患兒中，鼻病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒檢出率較高，其中呼吸道合胞病毒感染多見于1歲以下患兒；在1～3歲組患兒中，鼻病毒、甲型流感病毒、副流感病毒檢出率較高；在3～6歲組患兒中，肺炎支原體、鼻病毒、甲型流感病毒(或腺病毒)檢出率較高，其中支原體感染多見于3歲以上患兒；在≥6歲組患兒中，肺炎支原體、肺炎衣原體、鼻病毒(腺病毒或乙型流感病毒)檢出率較高。甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒具有明顯季節(jié)流行特征，以冬春季多見。

在兒童肺炎中，多種病原混合感染現(xiàn)象比較常見，以1～3歲組患兒混合感染檢出率最高。沒有發(fā)現(xiàn)超過兩種以上病原體混合感染的病例出現(xiàn)，估計(jì)與本研究納入患兒的病情不是太嚴(yán)重有關(guān)。