原酸和鐵冬青酸在鐵冬青種子沙藏前后的變化及其作用

林慶華

（福建省武平南坊國有林場(chǎng)，福建龍巖 364300）

鐵冬青（ILex rotunda），別名救必應(yīng)[1-2]。常綠喬木，枝繁葉茂，四季常青；10～12月，果熟時(shí)紅若丹珠，賞心悅目，是理想的園林觀果樹種。目前，鐵冬青尚無組培擴(kuò)繁成功的報(bào)道，扦插繁殖難度大，主要采用種子繁殖的方式進(jìn)行擴(kuò)繁育苗，種子因休眠需隔年才能萌發(fā)。為探索解除鐵冬青種子休眠的措施，通過HPLC檢測(cè)，鐵冬青種子中含有綠原酸和鐵冬青酸，且濕沙層積沙藏1年后，綠原酸和鐵冬青酸有不同程度的減少。通過鐵冬青酸標(biāo)準(zhǔn)品脅迫白菜種子發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)果表明鐵冬青酸會(huì)抑制白菜種發(fā)芽，熊愈輝、孫佳等已報(bào)道綠原酸是植物種子發(fā)芽抑制物[3-4]，所以，濕沙層積沙藏是解除鐵冬青種子休眠的一種手段。

1 試驗(yàn)儀器材料

1.1 種子

1.1.1 鐵冬青種子。2014年，龍巖市新羅區(qū)鑫林苗圃在新羅、永定、上杭、武平、連城5縣（區(qū)）開展鐵冬青優(yōu)樹選擇工作所選定的10號(hào)優(yōu)樹的種子千粒重為3.982g。2014年的種子自然風(fēng)干后，經(jīng)過濕沙層積沙藏1年；2015年的種子自然風(fēng)干后，室溫貯藏。

1.1.2 白菜種子。‘蘇州青’白菜種子，購自梅州市三農(nóng)種業(yè)發(fā)展有限公司，產(chǎn)自遼寧。純度≥96.0%，凈度≥98.0%，發(fā)芽率≥96.0%，水分≤7.0%。

1.2 試劑

HPLC檢測(cè)所用的綠原酸、鐵冬青酸的對(duì)照品均產(chǎn)自中國藥品生物制品檢定所，純度在98.0%以上，水為超純水。

綠原酸檢測(cè)：乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。鐵冬青酸檢測(cè)：乙腈、三氟乙酸為色譜純，甲醇為分析純。

脅迫試驗(yàn)：鐵冬青酸標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑為95%乙醇，稀釋水為蒸餾水。

1.3 儀器

AgiLent-1260高效液相色譜儀（真空在線脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱,DAD檢測(cè)器，Chemstation化學(xué)工作站），超聲儀，萬分之一電子天平，超聲清洗器。

2 試驗(yàn)方法

2.1 HPLC檢測(cè)

2016年4月，在閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室完成。

2.1.1 色譜條件。色譜柱PhenomenesC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫30℃。

2.1.2 樣品溶液的制備。將鐵冬青種子磨粉過60目篩，精確稱取0.200g樣品細(xì)粉，置于100mL錐形瓶中，加入70%甲醇40mL，室溫下超聲30min，取出放冷后過濾，重復(fù)提取3次，合并濾液并用70%甲醇定容于100mL量瓶中，用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。平行制備3份。

2.2 綠原酸檢測(cè)

2.2.1 流動(dòng)相。乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87），流速1.0m/min，檢測(cè)波長327nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制。精確稱取綠原酸對(duì)照品適量，加70%甲醇溶液制成含綠原酸25μg/mL的溶液，超聲溶解，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。將綠原酸對(duì)照品溶液用自動(dòng)進(jìn)樣器依次進(jìn)樣1、3、5、7、9uL，儀器輸出綠原酸對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 檢測(cè)。用自動(dòng)進(jìn)樣器將各樣品溶液進(jìn)樣50μL，測(cè)定峰面積，對(duì)照綠原酸對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器輸出樣品中綠原酸的含量。平行檢測(cè)3次，3次平行檢測(cè)結(jié)果的平均值即為鐵冬青種子中綠原酸的含量。

2.3 鐵冬青酸檢測(cè)

2.3.1 流動(dòng)相。乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液（55∶45），檢測(cè)波長：250nm。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備。精確稱取鐵冬青酸對(duì)照品0.200g，加70%甲醇溶液制成含鐵冬青酸的100μg/mL溶液，超聲溶解，搖勻，備用。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。將鐵冬青酸對(duì)照品溶液用自動(dòng)進(jìn)樣器分別進(jìn)樣10、30、50、70、90uL，儀器輸出鐵冬青酸對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.4 檢測(cè)。用自動(dòng)進(jìn)樣器將各樣品溶液進(jìn)樣25μL，測(cè)定峰面積，對(duì)照鐵冬青酸對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器輸出樣品中鐵冬青酸的含量。平行檢測(cè)3次，3次平行檢測(cè)結(jié)果的平均值即為鐵冬青種子中鐵冬青酸的含量。

2.4 脅迫試驗(yàn)

鐵冬青酸標(biāo)準(zhǔn)品脅迫白菜種子發(fā)芽試驗(yàn)，2016年3月在龍巖市林木種苗質(zhì)量檢測(cè)中心完成。

2.4.1 試液配制。將鐵冬青酸標(biāo)準(zhǔn)品用95%乙醇溶解，再用蒸餾水稀釋配制為2.0mg/L、1.25mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.125mg/L的溶液。再備1份清水作對(duì)照用。

2.4.2 種子處理。分撿飽滿、粒較大的白菜種子13份，100粒/份；將分撿好的白菜種子分別置于上述溶液中浸泡6h。用細(xì)濕沙鋪沙床，然后將浸泡過的白菜種子均勻地置于沙床上，最后用細(xì)濕沙薄蓋苗床，以保濕。將苗床置于平均溫度20℃、平均濕度65%的人工智能氣候室中。

2.4.3 種子發(fā)芽計(jì)量。2d后，幼苗開始出土，開始計(jì)算幼苗數(shù)量，直至連續(xù)5d無新幼苗出土為止。平行試驗(yàn)3次，3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值即為白菜種子的發(fā)芽率。

2.4.4 數(shù)據(jù)處理。鐵冬青酸脅迫白菜種子發(fā)芽試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SAS 8.2軟件進(jìn)行方差分析分析和多重比較分析[5]。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果

3.1.1 HPLC檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)計(jì)算，沒經(jīng)過濕沙層積沙藏的鐵冬青種子中綠原酸含量為596.40μg/g、鐵冬青酸含量為17.02μg/g；濕沙層積沙藏1年后，鐵冬青種子中綠原酸含量為127.40μg/g、鐵冬青酸含量為14.32μg/g。

3.1.2 脅迫試驗(yàn)結(jié)果。清水處理（CK）的白菜種子發(fā)芽率為67.5%。鐵冬青酸脅迫白菜種子的出苗影響較大，當(dāng)鐵冬青酸濃度達(dá)到1.0mg/L以上時(shí)，白菜種子的出苗率為0；鐵冬青酸濃度為0.125～0.5mg/L時(shí)，白菜種子有發(fā)芽，但與清水處理（CK）相比，白菜種子的發(fā)芽率下降（表1）。

表1 不同濃度鐵冬青酸處理后白菜種子的發(fā)芽率

3.2 分析

經(jīng)過對(duì)HPLC檢測(cè)結(jié)果分析，濕沙層積沙藏1年后，鐵冬青種子的綠原酸含量減少78.6%、鐵冬青酸含量減少15.9%。

方差分析表明，不同濃度鐵冬青酸處理白菜種子，發(fā)芽率呈極顯著差異（p=0.0003）。

多重比較分析表明，清水處理（CK）與試驗(yàn)處理1、2、3、4、的白菜種子的發(fā)芽率有極顯著差異，與處理5、6的白菜種子的發(fā)芽率無顯著差異；處理5、6與1、2、3、4的白菜種子的發(fā)芽率有極顯著差異；其它處理之間的白菜種子的發(fā)芽率無顯著差異（表2）。

表2 不同濃度鐵冬青酸處理后白菜種子發(fā)芽率的多重比較分析

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

鐵冬青種子含有綠原酸和鐵冬青酸，且2種化合物都是植物種子發(fā)芽抑制物。濕沙層積沙藏可以減少鐵冬青種子中綠原酸和鐵冬青酸的含量，1年后，綠原酸含量減少78.6%、鐵冬青酸含量減少15.9%。鐵冬青酸對(duì)白菜種子的發(fā)芽抑制作用顯著，當(dāng)鐵冬青酸濃度達(dá)到1.0mg/L以上時(shí)，對(duì)白菜種子的發(fā)芽起完全抑制作用；當(dāng)鐵冬青酸濃度為0.5mg/L時(shí)，對(duì)白菜種子的發(fā)芽有顯著抑制作用；當(dāng)鐵冬青酸濃度為0.125～0.2mg/L時(shí)，對(duì)白菜種子的發(fā)芽無顯著影響。

4.2 討論

①鐵冬青種子如果不經(jīng)過催芽處理，當(dāng)年播種是不會(huì)萌發(fā)的，經(jīng)過濕沙層積沙藏1年后，綠原酸和鐵冬青酸的含量會(huì)減少，種子也會(huì)發(fā)芽；種子含較高濃度的綠原酸和鐵冬青酸是導(dǎo)致鐵冬青種子休眠的原因之一。②濕沙層積沙藏1年后，鐵冬青種子能夠發(fā)芽，且綠原酸和鐵冬青酸的含量也會(huì)減少，所以，濕沙層積沙藏可以解除鐵冬青種子的休眠。③鐵冬青種子是否含有其它發(fā)芽抑制物，有待進(jìn)一步檢測(cè)，種子發(fā)芽抑制是種子內(nèi)源物之間互相影響的結(jié)果[3-4]。