SCD-1、LYSC在干眼癥病人結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中表達(dá)及意義

陳 旭，申 穎

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院近視眼激光治療中心）

干眼癥（dry eye syndrome，DES）是一種常見的眼科疾病，由于任何原因造成眼淚質(zhì)量、動力學(xué)異常改變，最終導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定、眼表損害，臨床上DES病人主要表現(xiàn)為眼睛干澀、易疲勞、有灼燒感或異物感、瘙癢、畏光、眼紅、視疲勞等[1]。中國DES患病率約為21%～30%，經(jīng)流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，DES發(fā)病病人受性別、年齡等因素的影響，研究發(fā)現(xiàn)女性病人多于男性病人，老年病人多于青年病人。DES發(fā)病原因眾多，臨床表現(xiàn)各異，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[2]。硬脂酰輔酶去飽和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD-1）是一種限速酶，其反應(yīng)的主要產(chǎn)物油酸是人脂肪組織三?；视偷闹饕舅?，與肥胖癥和代謝綜合征有關(guān)[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SCD-1敲除后小鼠表現(xiàn)出瞼板腺異常[4]。溶菌酶C（lysozyme C，LYSC）是所有生物體不同組織中的多種溶菌酶之一，是細(xì)胞中的關(guān)鍵免疫蛋白，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的抑菌活性[5，6]。Piera等[7]研究表明DES病人淚液中LYSC水平明顯低于正常人。關(guān)于SCD-1、LYSC與DES的相關(guān)研究在國內(nèi)鮮有報道，因此本研究通過測定SCD-1、LYSC在DES病人的結(jié)膜上皮細(xì)胞以及所分泌淚液中的表達(dá)水平，以探究其在DES病人結(jié)膜上皮細(xì)胞以及淚液中的表達(dá)關(guān)系及其特殊意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽取在醫(yī)院干眼門診就診的DES病人55例為DES組，其中男性21例，女性34例，年齡13～60歲，平均年齡38.52±7.36歲；同時選取于我院進(jìn)行體檢且眼科檢查無異常的非妊娠健康人群50例作對照組，其中男性20例，女性30例，年齡15～60歲，平均年齡38.26±7.10歲。DES病人納入標(biāo)準(zhǔn)均符合《干眼癥臨床診斷與治療》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)[9]：（1）近期眼部有炎癥反應(yīng)癥狀；（2）眼部曾做過手術(shù)或有眼角膜移植史；（3）近期一周使用過滴眼液；（4）合并免疫系統(tǒng)疾病。兩組研究對象年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與檢測 對照組在首次入院檢查時采集樣本，DES組病人分別在治療前后采集樣本。結(jié)膜上皮細(xì)胞采集：用干凈刀片輕刮研究對象上瞼結(jié)膜，放入凍存管中，置于-20℃冷凍冰箱保存，待測。淚液樣本采集：將0.9%生理鹽水注射液60μL滴入研究對象結(jié)膜囊內(nèi)，讓淚液與生理鹽水混合充分后，分別收集左、右眼所分泌的淚液并置于離心管中，混勻后放入-20℃冷凍冰箱保存待測。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測SCD-1水平 利用qRT-PCR技術(shù)檢測SCD-1水平。用Trizol試劑盒（貨號：RP2401，北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取總RNA。利用紫外分光光度計（UV-8000，上海精密儀表）檢測RNA純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：KL266，上?？道噬锟萍加邢薰荆CR擴(kuò)增試劑盒（貨號：ZY-14806，上海澤葉生物科技有限公司）均嚴(yán)格按照說明書操作步驟執(zhí)行，以GAPDH為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)循環(huán)參數(shù)：提前預(yù)熱至95℃，預(yù)變性30min；取出并降溫至90℃，變性5s；迅速降溫至58℃，退火20s；使溫度保持在60℃，延伸45s，共40個循環(huán)。引物序列由生工生物工程公司合成，SCD-1上游引物：5’-AGATACACTCTGGTGCTCAACGC-3’，下游引物：5’-CAGGATGTTCTCCCGAGATTGA-3’；GAPDH上游引物：5’-GACTCCGCTAACATCAAATG-3’，下游引物：5’-GAGGGAGTTGTCATATTTCTC-3’。用2-Ct法計算SCD-1相對表達(dá)量。

1.2.3 微量快速比濁法測定LYSC含量 利用微量快速比濁法測定LYSC含量[10]。LYSC測試盒、染色菌液制備、LYSC標(biāo)準(zhǔn)液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，均按照說明書操作步驟進(jìn)行。LYSC測試盒（JN1255-BRE）購自北京百奧萊博科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶干粉（LM100406-10）購自上海聯(lián)邁生物科技有限公司，酶標(biāo)儀（RT-6000）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 臨床指標(biāo)檢測

（1）淚膜破裂時間（break-up time，BUT）檢測：在所有研究對象下瞼結(jié)膜囊內(nèi)涂抹20 g/L的熒光素鈉溶液1μL，囑受試者閉眼使熒光素鈉溶液均勻的涂抹于角膜表層，通過裂隙燈在鈷藍(lán)光照射下仔細(xì)觀察角膜，囑觀察對象瞬目后保持不動，觀察在淚膜上產(chǎn)生的首個破裂點(diǎn)計為淚膜破裂時間。破膜時間<10 s則呈陽性結(jié)果，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取其平均值；（2）基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)（schirmer I test，SIT）：輕撥開受試者下眼瞼，避免刺激其流淚，囑受試者眼球上翻保持不動，在下眼瞼中外1/3結(jié)膜囊內(nèi)輕放入淚液分泌試紙，閉眼5 min后讀取試紙濕潤長度，結(jié)果以長度不足5 mm為干眼；（3）角膜熒光素染色（cornea fluorescein staining，CFS）：在研究對象的結(jié)膜囊內(nèi)滴入20 g/L的熒光素鈉溶液1μL，用0.9%生理鹽水沖洗后，通過裂隙燈在鈷藍(lán)光照射下仔細(xì)觀察角膜，以瞳孔中心為中點(diǎn)，將角膜劃分為4個象限，根據(jù)染色情況對角膜破損程度進(jìn)行評分（無染色記0分，離散點(diǎn)狀染色記1分，密集點(diǎn)狀染色記2分，片狀染色記3分），共計0～12分。給予已確診的DES病人0.1%玻璃酸鈉滴眼液（德國URSAPHARM公司，進(jìn)口藥品注冊證號H20150150）1滴/次，5～6次/天，2周后復(fù)查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

將所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)的統(tǒng)計學(xué)方法，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 將DES組和對照組治療前，在結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中所含SCD-1、LYSC的水平進(jìn)行比較

DES組病人結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中所含SCD-1、LYSC的水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表1）。

表1 DES組與對照組（治療前）在結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中SCD-1、LYSC水平比較(x±s，n)Tab.1 Comparison of SCD-1 and LYSC levels in conjunctival epithelial cells and tears between des group and control group（before treatment）（x±s，n）

2.2 對DES組病人治療前后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中SCD-1、LYSC水平比較

DES組病人經(jīng)治療后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中SCD-1、LYSC水平均高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表2）。

表2 DES組病人治療前后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中SCD-1、LYSC水平比較()Tab.2 Comparison of SCD-1 and LYSC levels in conjunctival epithelial cells and tears before and after treatment in DES group()

表2 DES組病人治療前后結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚液中SCD-1、LYSC水平比較()Tab.2 Comparison of SCD-1 and LYSC levels in conjunctival epithelial cells and tears before and after treatment in DES group()

組別治療前治療后n 淚液LYSC（mg/mL）1.08±0.24 1.59±0.32 9.456 0.000 55 50 SCD-1 0.84±0.13 0.91±0.18 0.338 0.021 F P--結(jié)膜上皮細(xì)胞SCD-1 0.81±0.11 0.87±0.14 2.499 0.014 LYSC（mg/mL）8.15±1.24 10.26±1.48 8.104 0.000

2.2 DES組病人治療前后臨床指標(biāo)變化

DES組病人經(jīng)治療后與治療前相比，BUT延長，SIT值增加，CFS評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表3）。

表3 DES組病人治療前后臨床指標(biāo)變化()Tab.3 Changes of clinical indexes in DES group before and after treatment()

表3 DES組病人治療前后臨床指標(biāo)變化()Tab.3 Changes of clinical indexes in DES group before and after treatment()

組別治療前治療后n 55 55 t P--BUT（s）5.10±1.26 8.57±3.42 7.061 0.000 SIT（mm）4.68±1.22 5.24±1.49 2.157 0.033 CFS評分3.86±1.05 3.46±1.02 2.026 0.045

2.3 DES組病人SCD-1、LYSC水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

DES組病人結(jié)膜上皮組織、淚液中所含SCD-1、LYSC的水平與BUT、SIT均呈正相關(guān)（P<0.05），與CFS評分均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）（見表4）。

表4 DES組病人結(jié)膜上皮組織中SCD-1、LYSC水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性Tab.4 Correlation between SCD-1、LYSC levels in conjunctival epithelium and clinical indexes in DES group

3 討論

DES可引起病人眼睛紅腫、充血，嚴(yán)重時會造成角結(jié)膜病變，影響視力。目前研究認(rèn)為，DES核心機(jī)制是由淚液高滲透壓和淚膜不穩(wěn)定引起的[11]。淚液量減少是淚液滲透壓增高的主要原因[12]，由于炎性介質(zhì)破壞淚腺組織及潛在可逆的流動性神經(jīng)分泌被阻斷，導(dǎo)致淚液量減少[13]。炎癥因子進(jìn)入淚液，引起眼瞼上皮細(xì)胞損壞，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定，促使淚液滲透壓進(jìn)一步升高，形成惡性循環(huán)。

SCD-1是一種含鐵的同素酶，可催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化，在脂肪酸合成和代謝中起關(guān)鍵作用[14]。Tan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p可能促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖，通過下調(diào)SCD和改變脂質(zhì)形成過程中的脂肪酸組成來抑制脂肪細(xì)胞分化。SCD-1也是癌癥的潛在藥物靶標(biāo)[16]，在癌細(xì)胞中，SCD-1的活性上調(diào)利于癌細(xì)胞增殖。Angelucci等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，膜流動性調(diào)節(jié)SCD-1表達(dá)上調(diào)，確立其在腫瘤細(xì)胞固有運(yùn)動和驅(qū)動腫瘤細(xì)胞運(yùn)動中的重要作用。淚液主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和粘液組成[18]。淚液蛋白在保護(hù)眼部表面免受外部傷害方面起重要作用[19]，還能調(diào)節(jié)眼部傷口愈合，有助于維持淚液膜的穩(wěn)定[20]。Inaba等[4]通過對SCD-1缺陷型（SCD-1 KO）小鼠淚液和眼組織的分析研究發(fā)現(xiàn)，SCD-1 KO小鼠淚腺脂質(zhì)代謝基因表達(dá)降低，并且缺乏SCD-1會引起與脂質(zhì)代謝基因表達(dá)相關(guān)的淚液量和粘蛋白水平代償性增加，為治療干眼癥提供新策略。眼淚的產(chǎn)生與人類代謝綜合癥之間存在某種聯(lián)系[21，22]。本研究結(jié)果顯示，DES病人結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚液中SCD-1水平低于正常對照組，治療后SCD-1水平高于治療前，提示SCD-1可能與淚液中的脂質(zhì)含量存在某種關(guān)系，參與DES作用。

溶菌酶（LYS）是一種堿性蛋白酶，廣泛存在于動植物各個組織及分泌物中[23]。在目前已知的6種LYS類型中，LYSC是研究最為廣泛、深入的類型[24]。LYSC是由主淚腺腺泡分泌的具有抗炎、抑菌、抗氧化等特性的多功能鏈多肽[25]。陳彥等探究2型糖尿病合并干眼癥病人LYS、表皮生長因子（EGF）和乳鐵蛋白（LF）的水平變化，結(jié)果顯示經(jīng)玻璃酸鈉滴眼液治療后，病人淚液中LYS、EGF和LF水平均顯著升高。有學(xué)者報道，LYS主要由嗜中性粒細(xì)胞分泌，當(dāng)眼結(jié)膜受到炎癥因子作用時，嗜中性粒細(xì)胞活性增加，刺激LYS分泌，使其水平升高，可作為指示機(jī)體防御功能的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，DES病人結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚液中LYSC水平低于正常對照組，治療后LYSC水平高于治療前，提示LYSC水平變化與DES的發(fā)生，發(fā)展有關(guān)。

本研究對DES病人治療前后的臨床指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，與治療前相比，治療后BUT延長，SIT值增加，CFS評分降低。淚液中的蛋白質(zhì)不僅起消毒殺菌作用，還提供脂質(zhì)載體，穩(wěn)定淚膜形態(tài)，保護(hù)滋養(yǎng)角膜及角膜上皮細(xì)胞。推測DES病人可能經(jīng)長期炎癥因子或者免疫因子侵蝕，眼表皮的免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，臨床癥狀加重，可以通過滴注人工淚液的方式減緩DES病癥。利用Pearson分析DES患者結(jié)膜上皮組織及淚液中SCD-1、LYSC水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示結(jié)膜上皮組織及淚液中SCD-1、LYSC水平SCD-1、LYSC水平與BUT、SIT均呈正相關(guān)，與CFS評分均呈負(fù)相關(guān)，提示SCD-1、LYSC可作為評價DES病人病情好壞的指標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，DES病人結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚液中SCD-1、LYSC水平均低于健康對照組。經(jīng)治療后，SCD-1、LYSC水平均高于治療前，且BUT延長，SIT值增加，CFS評分降低，提示SCD-1、LYSC水平變化可能與淚液中的脂質(zhì)存在某種關(guān)系，參與DES癥狀的發(fā)生、發(fā)展，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。