《腸道原蟲檢測(cè) 碘液染色涂片法》(WS/T 634-2018)標(biāo)準(zhǔn)解讀

周瑞敏，楊成運(yùn)，劉穎，張紅衛(wèi)

腸道原蟲是指寄生于人體胃腸道的一類單細(xì)胞真核生物，腸道原蟲病是嚴(yán)重影響人體健康的寄生蟲病?？捎玫庖喝旧科z測(cè)的常見腸道原蟲有溶組織內(nèi)阿米巴、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、人芽囊原蟲、結(jié)腸小袋纖毛蟲、結(jié)腸內(nèi)阿米巴、哈門內(nèi)阿米巴、微小內(nèi)蜒阿米巴、布氏嗜碘阿米巴等[1-3]。溶組織內(nèi)阿米巴呈世界性分布，據(jù)估計(jì)全世界有4.8億人感染溶組織內(nèi)阿米巴，出現(xiàn)臨床癥狀的有4 800萬人，每年有4萬～10萬人死于阿米巴病，其死亡率在寄生蟲病中僅次于瘧疾和血吸蟲病位居第三[4]。阿米巴痢疾是我國(guó)法定乙類傳染病。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲感染呈全國(guó)性分布，不僅在欠發(fā)達(dá)國(guó)家傳播流行，在發(fā)達(dá)國(guó)家也時(shí)有暴發(fā)流行，而且在同性戀人群可通過間接糞口傳播而被列為性傳播疾病[5,6]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)碘液染色涂片法檢測(cè)腸道原蟲尚無統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范[7,8]，因此亟需制定腸道原蟲檢測(cè)碘液染色涂片法技術(shù)規(guī)范。各級(jí)疾病預(yù)防控制和醫(yī)療機(jī)構(gòu)可根據(jù)技術(shù)規(guī)范，及時(shí)采取正確的檢測(cè)方法，提高腸道原蟲的病原學(xué)檢出率，有利于對(duì)病人早期診斷與及時(shí)治療，減少誤診、誤治和并發(fā)癥的發(fā)生。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制過程與方法

本標(biāo)準(zhǔn)是2016年度受原國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)政策法規(guī)司委托，由河南省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防控制中心、鄭州大學(xué)寄生蟲病研究所和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所等單位有關(guān)專家共同編制。按照寄生蟲病標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)的編制要求及程序，組成了標(biāo)準(zhǔn)編制專業(yè)工作組。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制定的相關(guān)文件精神與要求，工作組討論制訂了工作計(jì)劃及時(shí)間表，并進(jìn)行了人員分工，主要針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)編制過程中的相關(guān)資料及數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。

在編制過程中，先后召開了2次專家研討會(huì)，并函請(qǐng)全國(guó)從事腸道原蟲病預(yù)防控制、臨床、教學(xué)、科研等單位的30位專家征求意見。從標(biāo)準(zhǔn)起草至形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿過程中，工作組共收到144條專家反饋意見。根據(jù)專家反饋意見，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的正文和附錄部分逐條進(jìn)行了討論研究和修改，其中采納95條，部分采納24條，未采納25條。

本標(biāo)準(zhǔn)的起草結(jié)合了目前國(guó)內(nèi)外腸道原蟲流行現(xiàn)狀、檢測(cè)方法、診斷及碘液染色涂片法技術(shù)，兼顧了先進(jìn)性、科學(xué)性、廣泛性和實(shí)用性原則。本標(biāo)準(zhǔn)參照了2008年2月28日發(fā)布的中華人民共和國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 287-2008)，并遵循《衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的相關(guān)規(guī)定，根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》的要求進(jìn)行編制，最終形成了《腸道原蟲檢測(cè) 碘液染色涂片法》(WS/T 634-2018)衛(wèi)生行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)，并由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)于2018年9月26日發(fā)布，2019年4月1日實(shí)施。

2 標(biāo)準(zhǔn)的正文內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)。正文由六部分組成，明確了標(biāo)準(zhǔn)適用范圍，釋義了有關(guān)術(shù)語和定義，列舉了所引用的標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范及檢測(cè)所需的設(shè)備、試劑、材料，規(guī)范了檢測(cè)步驟。從樣本準(zhǔn)備、樣本檢測(cè)、鏡下觀察、結(jié)果判定四個(gè)方面詳細(xì)闡述了碘液染色涂片法檢測(cè)腸道原蟲的步驟。

該標(biāo)準(zhǔn)在編制過程中對(duì)國(guó)內(nèi)外腸道原蟲流行現(xiàn)狀及檢測(cè)方法進(jìn)行了全面分析，對(duì)碘液染色涂片法技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了認(rèn)真調(diào)研，學(xué)習(xí)與研究了標(biāo)準(zhǔn)制定的相關(guān)文件精神與要求，參考了部分寄生蟲病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范，充分考慮了我國(guó)各級(jí)疾控機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備設(shè)施，使標(biāo)準(zhǔn)更適合我國(guó)原蟲病防治和研究工作的實(shí)際需要，可為原蟲病防治研究提供可靠的防治與監(jiān)測(cè)依據(jù)，提高流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷的質(zhì)量。

2.1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了腸道原蟲碘液染色涂片檢測(cè)的技術(shù)規(guī)范，適用于各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)腸道原蟲的檢測(cè)。

2.2 術(shù)語和定義 本標(biāo)準(zhǔn)明確了腸道原蟲、包囊和碘液的定義，并進(jìn)行了科學(xué)解釋。

2.2.1 腸道原蟲 寄生在人體腸道的單細(xì)胞真核生物，常見的腸道原蟲有阿米巴、鞭毛蟲、孢子蟲、纖毛蟲和人芽囊原蟲等。

2.2.2 包囊 原蟲不活動(dòng)、不攝取營(yíng)養(yǎng)的階段。

2.2.3 碘液 碘和碘化鉀的水溶液，用于檢查原蟲的包囊。

2.3 儀器設(shè)備 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)采用碘液染色涂片法檢測(cè)腸道原蟲必要的儀器設(shè)備及技術(shù)參數(shù)提出了要求，必要的儀器設(shè)備應(yīng)包括生物顯微鏡、電子天平和測(cè)微尺等。其中生物顯微鏡技術(shù)參數(shù)要求物鏡 10×、40×、100×，目鏡 10×；電子天平技術(shù)參數(shù)要求稱量范圍0～100 g，精度0.1 g；測(cè)微尺技術(shù)參數(shù)要求目鏡測(cè)微尺精度0.1 mm，物鏡測(cè)微尺精度0.01 mm。

2.4 試劑材料 本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)采用碘液染色涂片法檢測(cè)腸道原蟲的主要試劑材料及技術(shù)參數(shù)提出了要求。本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試劑要求簡(jiǎn)單，主要試劑為碘液，并在附錄A中給出了配方及配制方法。在所需材料中，提供了采樣、樣本制作及試劑配制過程中所需材料，并對(duì)每種材料提供了技術(shù)參數(shù)。

2.5 檢測(cè)步驟 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了“腸道原蟲檢測(cè) 碘液染色涂片法”的操作規(guī)程及技術(shù)規(guī)范要求。本標(biāo)準(zhǔn)從樣本準(zhǔn)備與檢測(cè)、鏡下觀察及結(jié)果判定四個(gè)方面對(duì)操作過程的注意事項(xiàng)和技術(shù)要求進(jìn)行了詳細(xì)描述，并在附錄部分作了進(jìn)一步的補(bǔ)充。

2.5.1 樣本準(zhǔn)備 明確了檢測(cè)樣本為新鮮糞便；對(duì)樣本的標(biāo)識(shí)、檢測(cè)時(shí)限及保存條件進(jìn)行了明確。

2.5.2 樣本檢測(cè) 明確了樣本的碘液涂片制備過程。對(duì)碘液量、糞便量及糞膜的厚度進(jìn)行了明確。

2.5.3 鏡下觀察 明確了鏡下觀察時(shí)的物鏡倍數(shù)及觀察順序。

2.5.4 結(jié)果判定 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，以觀察全部涂片發(fā)現(xiàn)包囊或卵囊為陽性，未發(fā)現(xiàn)包囊或卵囊判定為陰性。

3 標(biāo)準(zhǔn)的附錄內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)有5個(gè)資料性附錄，詳細(xì)介紹了試劑配制、涂片制備、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)、檢測(cè)注意事項(xiàng)，對(duì)常見腸道原蟲包囊或卵囊形態(tài)特征進(jìn)行了描述，并提供了形態(tài)模式圖及形態(tài)相似的常見雜質(zhì)模式圖[9]，便于鑒別診斷。

附錄A為碘液的配置。本附錄對(duì)碘液的配方及配制方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。因碘液有遇強(qiáng)光易分解的特性，強(qiáng)調(diào)需將配制好的碘液貯于有瓶塞的棕色試劑瓶中。

附錄B為腸道原蟲檢測(cè)。本附錄對(duì)“腸道原蟲檢測(cè) 碘液染色涂片法”操作規(guī)程及注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳細(xì)的描述，包括碘液涂片的制備、觀察順序及方法和結(jié)果判定中的關(guān)鍵點(diǎn)，同時(shí)對(duì)如何避免漏檢、防止糞便污染、避免糞便污染環(huán)境和做好安全防護(hù)等方面提出要求。對(duì)邁氏唇鞭毛蟲、貝氏等孢球蟲、隱孢子蟲和結(jié)腸小袋纖毛蟲的包囊或卵囊形態(tài)特征進(jìn)行描述，并對(duì)幾種原蟲在檢測(cè)中應(yīng)特別注意的事項(xiàng)進(jìn)行詳細(xì)描述。附錄B中提供了涂片制備的模式圖。

附錄C為常見腸道原蟲包囊或卵囊形態(tài)模式圖。本附錄提供了20種常見腸道原蟲包囊或卵囊形態(tài)結(jié)構(gòu)參考模式圖，對(duì)于其它非典型形態(tài)及其它非常見原蟲未提供參考模式圖，需要參考其它文獻(xiàn)。

附錄D為常見腸道原蟲及其包囊或卵囊形態(tài)特征。本附錄對(duì)阿米巴、纖毛蟲、鞭毛蟲、人牙囊原蟲和孢子蟲等5類常見腸道原蟲及其包囊或卵囊形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)描述，并對(duì)同類中的不同蟲種或型別進(jìn)行描述。

附錄E為糞便中與包囊形態(tài)相似的常見雜質(zhì)。本附錄對(duì)鏡檢過程中，糞便中與包囊形態(tài)相似的中性脂肪、綜合脂肪、膿細(xì)胞、花粉、真菌孢子等5種常見雜質(zhì)進(jìn)行了形態(tài)模式圖圖示。

4 標(biāo)準(zhǔn)施行和宣貫重點(diǎn)

碘液染色涂片法是診斷腸道原蟲病常用的病原學(xué)檢測(cè)方法。目前，碘液染色涂片法檢測(cè)原蟲包囊或卵囊尚缺乏統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范，由于原蟲蟲體小，檢查方法復(fù)雜，對(duì)鏡檢人員檢測(cè)技能要求高，診斷難度較大。為加強(qiáng)對(duì)腸道原蟲檢測(cè)的管理工作，提高檢測(cè)水平，保證檢測(cè)質(zhì)量，制定本標(biāo)準(zhǔn)。為充分發(fā)揮該方法在我國(guó)腸道原蟲病診斷過程中的作用，提高醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)腸道原蟲的檢測(cè)水平，應(yīng)加強(qiáng)本標(biāo)準(zhǔn)的宣傳貫徹力度，進(jìn)一步規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施。

在本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施及宣貫工作中，應(yīng)重點(diǎn)把握以下幾點(diǎn)：①本標(biāo)準(zhǔn)不適用于稀便或膿血便中滋養(yǎng)體的檢查，滋養(yǎng)體需用生理鹽水直接涂片法檢查。②為避免造成漏檢，應(yīng)隔天采集糞便，連續(xù)3次以上；對(duì)于一些慢性患者，糞檢應(yīng)持續(xù)1～3周，多次檢查，以確保無漏診病人。③檢測(cè)邁氏唇鞭毛蟲時(shí)，應(yīng)采集新鮮糞便做碘液染色，在40×和100×物鏡下觀察，以提高查到包囊的機(jī)會(huì)，對(duì)未檢出的個(gè)別標(biāo)本可考慮用隔日復(fù)檢的方法以提高檢出率。④隱孢子蟲卵囊在碘液涂片檢測(cè)中漏檢率較高，常用抗酸染色法進(jìn)行檢測(cè)。⑤等孢球蟲卵囊微小，顏色淺，且蟲體在體外容易裂解，很容易漏檢。采用2.5%重鉻酸鉀保存的糞便標(biāo)本，可殺滅全部細(xì)菌，有利于檢出卵囊，并可以長(zhǎng)久保存標(biāo)本。⑥急性隱孢子蟲病人，其腹瀉糞便中含有較多卵囊，一般碘液染色涂片法即可。如檢查與病人或家畜接觸過的人群、復(fù)查治療后的病人時(shí)，采用濃集法可提高檢出率，判斷困難時(shí)需金胺—酚染色、改良抗酸染色等特殊染色進(jìn)行鑒別。⑦結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊的排出常呈間歇性，需反復(fù)檢查。

本標(biāo)準(zhǔn)在編制過程中采用查詢文獻(xiàn)資料、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研、總結(jié)以往經(jīng)驗(yàn)等方式，并廣泛征求醫(yī)院、疾病預(yù)防控制中心、寄生蟲病防治研究所、高等院校等各領(lǐng)域?qū)＜业囊庖娺M(jìn)行編制，確保了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性和科學(xué)性。在做好本標(biāo)準(zhǔn)宣貫的同時(shí)，應(yīng)廣泛開展本標(biāo)準(zhǔn)操作的技能培訓(xùn)，使各使用部門及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員能夠熟練掌握本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容和條款，熟練應(yīng)用碘液染色涂片法檢測(cè)腸道原蟲。