腎臟常溫機(jī)械灌注保存的研究進(jìn)展與展望

王南南，鄧旭，史源，陳立明，屈波（. 錦州醫(yī)科大學(xué)武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 006；. 天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 009； . 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科，天津 006）

早在1935 年Carrel 等［1］就探索了腎臟常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）保存技術(shù)，由于技術(shù)復(fù)雜以及靜態(tài)低溫保存（static cold storage，SCS）技術(shù)在供腎保存方面的成功，NMP 技術(shù)一直未得到充分的關(guān)注。近年來由于邊緣供體腎臟應(yīng)用的增加，SCS 已不能達(dá)到滿意的保存效果，主要表現(xiàn)為原發(fā)性無功能（primary nonfunction，PNF）和移植物功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）發(fā)生率的增加，加之心肺旁路外科設(shè)備與技術(shù)的發(fā)展，NMP 保存供腎再次成為腎移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［2］。就保持供腎正常生理狀態(tài)、提供能量代謝底物、支持主動(dòng)修復(fù)所需的合成功能、清除毒性產(chǎn)物和評(píng)估供腎質(zhì)量等方面而言，相對(duì)于低溫保存技術(shù)，采用NMP 保存供腎具有巨大的潛在優(yōu)勢［3］。盡管NMP 在供腎保存中具有諸多優(yōu)勢，但最佳NMP 條件仍不明確，現(xiàn)就NMP 灌注液、灌注壓力、灌注時(shí)間/時(shí)機(jī)、灌注溫度與氧氣濃度等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 灌注液

1.1 人工灌注液：全氟化碳是一種具有攜氧能力的惰性溶液，1994 年，Brasile 等［4］就以全氟化碳乳液為基礎(chǔ)開發(fā)出了可用于NMP 的非細(xì)胞組分灌注液，他們?cè)谌I自體移植模型上證明了以全氟化碳乳液為基礎(chǔ)的灌注液用于NMP 的可行性及安全性。2002 年與2010 年Brasile 等［5-6］在心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）供腎自體移植犬模型上再次證明該灌注液用于NMP 的可行性、有效性及安全性。第一代全氟化碳液相對(duì)不穩(wěn)定，具有可變的半衰期、不能進(jìn)行滅菌及注入體內(nèi)后會(huì)引起諸多不良反應(yīng)等缺點(diǎn)，而第二代、第三代全氟化碳液制造復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，限制了其在臨床的應(yīng)用［7］。

1984 年Daniels 等［8］開發(fā)了一種以無基質(zhì)血紅蛋白為基礎(chǔ)的灌注液，研究發(fā)現(xiàn)該灌注液在腎臟NMP 保存中的作用有限，且會(huì)對(duì)腎臟造成毒性效應(yīng)。2000 年Stubenitsky 等［9］將一種更加穩(wěn)定的吡哆酸結(jié)合血紅蛋白聚乙烯液用于NMP，比較了兩種不同供腎保存策略（SCS +簡短N(yùn)MP 組比單純SCS 組）對(duì)腎移植預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，與單純SCS 組相比， 移植后SCS +簡短N(yùn)MP 組生存率明顯升高（90%比73%），24 h 內(nèi)血清肌酐水平與血清肌酐峰值明顯降低。

2009 年Gage 等［10］研 究發(fā) 現(xiàn)：與UW 液 相比，在室溫下采用Lifor 液（一種含營養(yǎng)素、生長因子和非蛋白攜氧物質(zhì)的人造灌注液）機(jī)械灌注豬DCD 供腎具有更高的腎血流量和更低的腎內(nèi)阻力，該研究沒有報(bào)道關(guān)于腎臟預(yù)后的信息，然而，較高的灌注流量在一定程度上意味著細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到了更好的保存。該研究中整個(gè)機(jī)械灌注期間灌注裝置溫度始終低于25℃，因此Lifor 液是否適用于NMP仍有待進(jìn)一步研究。除上述人造灌注液外，有可能成為NMP 灌注液的攜氧物質(zhì)還有AQIX-RS-I、HemarinaM101 等［11-13］。

1.2 含血灌注液：與人造灌注液相比，含血灌注液可為供腎提供一個(gè)更加接近生理狀態(tài)的環(huán)境，早期認(rèn)為含血灌注液具有溶血、血小板激活、紅細(xì)胞攜氧能力退化、高腎內(nèi)阻力以及組織水腫等諸多缺點(diǎn)，近年來隨著心肺旁路外科設(shè)備與技術(shù)的發(fā)展，上述局限性明顯改善［14］。2008 年，Bagul 等［15］報(bào)道將含洗滌紅細(xì)胞的灌注液用于NMP 保存SCS 后的DCD 豬腎，他們?cè)诠嘧⒁褐刑砑恿司w液、抗菌藥物、抗氧化劑和血管擴(kuò)張劑以增加腎臟血流并保護(hù)腎臟，結(jié)果顯示該NMP 系統(tǒng)可恢復(fù)耗竭的三磷酸腺苷水平，逆轉(zhuǎn)部分SCS 損傷。 2011 年，Hosgood 等［16］首次報(bào)道將含壓積紅的灌注液用于臨床供腎的NMP 保存，2013 年Nicholson等［17］首次報(bào)道將含血灌注液用于NMP 的臨床研究，該研究比較了兩種不同保存策略（SCS +簡短N(yùn)MP 組比單純SCS 組）對(duì)擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供腎保存效果的影響，結(jié)果顯示，與單純SCS 組相比，SCS +簡短N(yùn)MP 組的DGF 發(fā)生率明顯降低（5.6%比36%）。 2017 年Urcuyo 等［18］欲采用3 種不同條件（體溫全血、體溫含全血Steen 液、21℃單純Steen 液）分別機(jī)械灌注DCD 豬腎24 h，然而體溫全血組由于腎內(nèi)阻力快速增高而早期終止了灌注，結(jié)果顯示，體溫全血組腎小球和腎小管明顯壞死，體溫含全血Steen 液組出現(xiàn)了明顯的酸中毒、高血鉀及腎小球和腎小管壞死，僅21℃單純Steen 液組呈現(xiàn)出可接受的腎內(nèi)阻力與組織學(xué)結(jié)果。

近年來研究表明白細(xì)胞在缺血/再灌注損傷中具有重要作用，與全血相比，在NMP 中采用以去白細(xì)胞全血為基礎(chǔ)的灌注液可抑制滲出、炎癥反應(yīng)及凋亡相關(guān)介質(zhì)的釋放，改善循環(huán)和腎臟功能，降低損傷的可能性［19-20］。近年來研究多將去白紅細(xì)胞或洗滌紅細(xì)胞懸浮于晶體液或者Steen 液中作為灌注液，保存效果較為理想［21-25］。

2 灌注壓力

平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）是NMP 的一項(xiàng)重要變量，然而最佳MAP 尚無定論。2014 年P(guān)atel 等［26］在豬DCD 供腎再灌注模型上探索了NMP 灌注壓對(duì)供腎保存效果的影響，腎臟進(jìn)行23 h SCS 后以55 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa）或者75 mmHg 的MAP 進(jìn)行1 h NMP，然后兩組腎臟均以85 mmHg 的MAP 進(jìn)行3 h 自體全血常溫再灌注以評(píng)估腎臟質(zhì)量。NMP 期間75 mmHg 組腎臟血流量、氧氣消耗量與尿量均明顯高于55 mmHg組，體外再灌注期間75 mmHg 組尿液中內(nèi)皮素-1 水平明顯低于55 mmHg 組，與55 mmHg 組相比，體外再灌注后75 mmHg 組腎小管損傷嚴(yán)重程度明顯改善。他們認(rèn)為：與55 mmHg 相比，以 75 mmHg 的MAP 進(jìn)行NMP 可減輕腎小管和內(nèi)皮損傷。

3 時(shí)間/時(shí)機(jī)

根據(jù)NMP 應(yīng)用時(shí)間/時(shí)機(jī)的不同，可將目前的NMP 臨床前研究與臨床研究分為3 種主要類型：SCS +簡短N(yùn)MP + SCS、SCS + NMP、持續(xù)NMP。其中SCS + NMP 又可根據(jù)NMP 持續(xù)時(shí)間的不同分為3 種類型：SCS +簡短N(yùn)MP、SCS +中等時(shí)間NMP、SCS +延長時(shí)間NMP。

早期腎臟保存的目標(biāo)是延長保存時(shí)間為交叉配型以及抗體篩查爭取時(shí)間。1980 年，van der Wijk等［27］采用低溫保存技術(shù)與NMP 技術(shù)相結(jié)合的方法成功保存犬腎144 h，他們采取的保存策略為：SCS +簡短N(yùn)MP + SCS。隨后Rijkmans 等［28］采用低溫機(jī)械灌注+簡短N(yùn)MP+低溫機(jī)械灌注的保存策略成功保存犬腎6 d，該研究表明：NMP 可預(yù)防低溫保存引起的不可逆損傷，NMP 對(duì)供腎尤其是腎小管的保存是有利的。與人或者豬相比，犬腎可耐受大量缺血損傷，這些早期研究的臨床適用性有待進(jìn)一步研究。2014 年，Hosgood 等［29］報(bào)道1 例人類供腎經(jīng)過10 h 29 min SCS + 1 h NMP + 5 h 21 min SCS 后被成功移植的案例，移植后供腎功能良好，沒有任何并發(fā)癥。

2000 年Stubenitsky 等［9］在DCD 供腎自體移植犬模型上比較了兩種不同保存策略（24 h SCS 比 24 h SCS + 3 h NMP）對(duì)供腎移植預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，與單純SCS 組相比，SCS + NMP 組再灌注損傷明顯減輕，DGF 與PNF 的發(fā)生率均明顯降低。Hosgood 等［30］在豬DCD 供腎模型上研究發(fā)現(xiàn)：體外再灌注前進(jìn)行簡短N(yùn)MP 可恢復(fù)供腎ATP 水平，逆轉(zhuǎn)部分SCS 產(chǎn)生的損傷；與單純SCS 相比，體外再灌注前進(jìn)行簡短N(yùn)MP 可改善腎臟的代謝功能，減輕輸尿管損傷；低溫機(jī)械灌注+簡短N(yùn)MP的保存策略是可行的，移植后未見技術(shù)相關(guān)性并發(fā)癥，與單純HMP 組相比，HMP+簡短N(yùn)MP 組腎臟功能改善［15，30-31］。2011 年與2013 年，Hosgood 等［16］在臨床上再次證明SCS +簡短N(yùn)MP 策略保存供腎的可行性、有效性與安全性［16-17］。

2016 年Kaths 等［21］在豬腎自體異位移植模型上比較了兩種不同保存策略（8 h SCS 比8 h NMP）對(duì)腎移植預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，移植后第10 天NMP 組血清肌酐水平和尿素氮水平與移植前基礎(chǔ)水平相當(dāng)，SCS 組腎功能參數(shù)明顯劣于移植前基礎(chǔ)水平。2017 年Kaths 等［24］在DCD 供腎自體異位移植豬模型上再次探索了上述兩種保存策略對(duì)腎移植預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：移植后1 周內(nèi)NMP 組血清肌酐值與肌酐峰值水平明顯低于SCS 組，移植后第4 天NMP 組肌酐清除率明顯高于SCS 組。他們認(rèn)為：持續(xù)NMP 保存策略可改善DCD 供腎的功能，NMP 可能有助于擴(kuò)大供體池，降低移植后DGF 發(fā)生率。同年，史源等［32］在DCD 供腎自體異位移植豬模型上比較了兩種不同保存策略（8 h SCS 比8 h NMP）對(duì)供腎保存效果的影響，結(jié)果顯示，移植后持續(xù)NMP 組供腎功能優(yōu)于SCS 組。

2016 年與2017 年Kaths 等［23，25］在DCD 供腎自體移植豬模型上研究發(fā)現(xiàn)：SCS 后中等時(shí)間或者延長時(shí)間NMP 優(yōu)于簡短N(yùn)MP，SCS 后簡短N(yùn)MP的獲益有限，持續(xù)NMP 優(yōu)于單純SCS 或者SCS + NMP；仍需進(jìn)一步探索NMP 的最佳灌注時(shí)間/ 時(shí)機(jī)以設(shè)計(jì)合適的臨床研究，采用持續(xù)NMP 替代SCS 以消除/最小化SCS 損傷可能是未來的方向。

4 溫度與氧氣

4.1 溫度：溫度是機(jī)械灌注的一項(xiàng)關(guān)鍵參數(shù)，直接影響著機(jī)械灌注對(duì)供腎的保存效果。Adams 等［33］在DCD 供腎豬模型上探索了SCS +簡短N(yùn)MP 策略中溫度對(duì)供腎保存效果的影響，結(jié)果表明：與32℃組相比，37℃組的腎小管和腎臟功能得到了更好的保存。NMP 關(guān)于溫度的另一個(gè)問題是如何最佳地復(fù)溫供腎，2015 年Schopp 等［34］提出了控制性氧合性復(fù)溫（controlled oxygenated rewarming， COR）的概念，他們?cè)贒CD 供腎體外再灌注豬模型上比較了3 種不同保存策略（18 h HMP 比18 h SCS + 3 h HMP 比18 h SCS + 3 h COR）對(duì)供腎保存效果的影響，結(jié)果顯示，與單純HMP 組與SCS + HMP 組相比，保存后再灌注期間COR 組肌酐和尿素清除率明顯升高，線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡狀態(tài)明顯改善，氧氣消耗量明顯增加，腎組織NAD 水平明顯升高，caspase-9 激活誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡明顯減輕。Minor 等［35］在豬腎體外再灌注模型上探索了SCS 后COR（18 h SCS 比18 h SCS + 90 min COR）對(duì)供腎保存效果的影響，結(jié)果表明，與單純SCS 組相比，體外再灌注期間SCS + COR 組腎臟功能明顯改善。

4.2 氧氣濃度：Nicholson 等與Kaths 等［23，25］所實(shí)施的NMP 相關(guān)研究均采用經(jīng)CO2平衡的高濃度氧氣作為灌注氣體以確保充分的氧合并維持酸堿平 衡［15，30-31，36］。然而高氧環(huán)境可能會(huì)促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，誘發(fā)氧化性損傷，Kron 等［37］在大鼠模型上研究發(fā)現(xiàn)NMP 保存供腎期間高氧環(huán)境誘發(fā)了較強(qiáng)的氧化應(yīng)激損傷。Hameed 等［38］在豬DCD 供腎模型上研究發(fā)現(xiàn)采用經(jīng)CO2平衡的氧氣作為簡短N(yùn)MP 氣體對(duì)供腎的保存效果優(yōu)于純氧。

5 展 望

與低溫技術(shù)相比，NMP 具有諸多優(yōu)勢，已有大量臨床前研究證明其在腎臟保存方面的可行性、安全性及有效性，雖然NMP 在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，但初步結(jié)果是積極的。就技術(shù)本身而言，NMP 仍未發(fā)展成熟，最佳的灌注條件 （例如灌注液、時(shí)間/時(shí)機(jī)、灌注壓力、溫度與氧氣濃度等）尚無定論。就成本-效益而言，如果NMP 能夠確保捐獻(xiàn)池供體的利用率增加或降低器官廢棄率，NMP 具有巨大的潛在性經(jīng)濟(jì)效益。就臨床用途而言，NMP 不僅可改善供腎的保存效果，還可為移植前供腎的體外修復(fù)/治療、供體質(zhì)量評(píng)估提供機(jī)會(huì)，這將增加可用于移植的供腎數(shù)量并減少不必要的供腎廢棄。隨著上述問題的逐漸闡明，更多的腎臟將被最佳化保存并被成功移植。