儲(chǔ)藏期內(nèi)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)印度谷螟生長發(fā)育的影響

吳學(xué)友，陳二虎，王康旭，唐培安

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，糧食儲(chǔ)運(yùn)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

害蟲為害是制約稻谷糧食安全的主要威脅之一，與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中的化學(xué)藥劑防治相比，轉(zhuǎn) Bt基因水稻抗蟲殺蟲受到研究者的青睞[1-3]。轉(zhuǎn) Bt基因水稻的靶標(biāo)害蟲主要是農(nóng)田害蟲，然而籽粒中存在Bt蛋白，轉(zhuǎn)基因稻谷的殺蟲特性在儲(chǔ)藏期間也會(huì)對(duì)儲(chǔ)糧害蟲產(chǎn)生影響，將導(dǎo)致糧倉生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化，進(jìn)而影響儲(chǔ)藏期的稻谷品質(zhì)[4-5]。印度谷螟Plodia interpunctella（Hübner），隸屬于鱗翅目卷螟科，是世界性的倉儲(chǔ)害蟲之一，其幼蟲喜剝蝕糧食子粒的胚部和表皮，吐絲結(jié)網(wǎng)造成糧食結(jié)塊變質(zhì)，其成蟲善飛，易造成儲(chǔ)糧的重復(fù)感染[6-8]。因此，開展儲(chǔ)藏期內(nèi)轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)儲(chǔ)糧害蟲印度谷螟生長發(fā)育的影響對(duì)加深稻谷安全儲(chǔ)藏認(rèn)知具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試稻谷

轉(zhuǎn)基因稻谷華恢1號(hào)：以pBluescript II KS(+/–)phagemid為載體，通過基因槍法介導(dǎo)，將抗蟲基因Cry1Ab/Cry1Ac導(dǎo)入水稻明恢63獲得轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻，標(biāo)記為HH/Bt（圖1-1）。非轉(zhuǎn)基因稻谷明恢63：轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻華恢1號(hào)的非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)照，標(biāo)記為MH/CK（圖1-2）。上述兩種稻谷由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

圖1 -1 轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（HH/Bt）

圖1 -2 非轉(zhuǎn)基因親本（MH/CK）

1.2 供試蟲源

印度谷螟采自南京財(cái)經(jīng)大學(xué)儲(chǔ)糧害蟲防控實(shí)驗(yàn)室的模擬糧倉中，后在養(yǎng)蟲室內(nèi)人工飼養(yǎng)數(shù)代。將印度谷螟配對(duì)成蟲接種于含有100 g人工飼料的玻璃瓶中（經(jīng)160 ℃干熱滅菌），產(chǎn)卵24 h后移出成蟲，挑取新鮮卵粒置于培養(yǎng)小室（Φ30 mm×15 mm），添加適量人工飼料（大豆粉和酵母粉按質(zhì)量比20∶1混合而成）。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃、75%±5% RH、24 h無光照。

1.3 主要儀器設(shè)備

JLGJ4.5型檢驗(yàn)礱谷機(jī)：浙江臺(tái)州市糧儀廠；FW80型高速粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；SL1202N型分析天平：Denver公司；PQX-300D型人工氣候箱：寧波東南儀器有限公司；SZM45型體式顯微鏡：寧波舜宇儀器設(shè)備有限公司。

1.4 稻谷飼料樣品配制

稻谷HH/Bt和MH/CK樣品分別經(jīng)除雜，礱谷、再除雜，粉碎等處理后獲得MH/CK、HH/Bt糙米粉，隨后向HH/Bt糙米粉中添加MH/CK以制備HH/Bt含量分別為80%、50%、20%、10%、5%和2%的混合糙米粉，以MH/CK（0%）、HH/Bt（100%）糙米粉分別作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

1.5 試蟲處理

取新羽化的印度谷螟成蟲 30只（雌雄比為1∶1），產(chǎn)卵后在卵粒周圍添加適量配制好的稻谷飼料，置于養(yǎng)蟲室（75% RH，24 h無光照）。每24 h觀察一次，記錄卵的孵化數(shù)、蟲齡、死亡數(shù)和羽化數(shù)等信息。待試蟲成蟲羽化后，立即進(jìn)行雌雄配對(duì)，單對(duì)觀察并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵數(shù)及成蟲壽命。模擬溫度為：21、24、30、33、36和39 ℃，每個(gè)處理200頭重復(fù)，對(duì)照組飼料為MH/CK糙米粉。

1.6 發(fā)育速率與溫度關(guān)系模擬

印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率與溫度的關(guān)系曲線模擬依據(jù)Briere等[9]推導(dǎo)的非線性模型進(jìn)行，并利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸方程擬合，計(jì)算印度谷螟生長發(fā)育各蟲態(tài)發(fā)育參數(shù)（a、T0、TL），并確定印度谷螟各蟲態(tài)的發(fā)育速率與溫度關(guān)系的非線性模型。

Briere等[9]推導(dǎo)的昆蟲種群生長發(fā)育速率與溫度關(guān)系的非線性模型為：

其中，R(T)表示平均發(fā)育速率，是昆蟲某一蟲態(tài)發(fā)育所需時(shí)間的倒數(shù)，單位為d–1；T表示溫度，T0表示最低發(fā)育溫度，TL表示最高發(fā)育溫度，單位均為℃，在計(jì)算之初，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察予以推測(cè)大概范圍；a表示經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，某一昆蟲種群各蟲態(tài)的a值在一定范圍內(nèi)。依據(jù)上述非線性模型方程。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，通過獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)比較分析轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)印度谷螟發(fā)育的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著差異水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)印度谷螟的致死效應(yīng)

以不同含量轉(zhuǎn)基因稻谷糙米粉飼喂印度谷螟初孵幼蟲，觀察記錄1至3齡幼蟲生物學(xué)特性以及存活情況。研究發(fā)現(xiàn)，印度谷螟初孵幼蟲即開始取食，對(duì)含HH/Bt的飼料并無明顯的趨避行為表現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)與已有報(bào)道相一致[10-11]。幼蟲在取食含轉(zhuǎn)基因稻谷的飼料后中毒表現(xiàn)為：首先離開飼料，隨之其運(yùn)動(dòng)能力減弱，糞便含水狀物，其腹部有明顯凹陷，皺縮，身體蜷縮，干癟發(fā)黃，最后死亡。由此可見，轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)印度谷螟的致死效果，這一研究結(jié)果與此前報(bào)道類似[10-11]。

致死率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對(duì)印度谷螟低齡幼蟲（1至 3齡幼蟲）具有較強(qiáng)的致死效應(yīng)[10-11]，在HH/Bt含量高于20%時(shí)，初孵1齡幼蟲在尚未進(jìn)入2齡期就已經(jīng)全部死亡。在2%和5%HH/Bt含量時(shí)，幼蟲在3齡結(jié)束進(jìn)入 4齡時(shí)的死亡率分別為 60.0%和 68.3%（詳見表1）。因此，本研究選取2% HH/Bt作為實(shí)驗(yàn)組飼料來探討轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對(duì)印度谷螟生長發(fā)育的影響。

2.2 轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)印度谷螟發(fā)育歷期的影響

在模擬 21～36 ℃試驗(yàn)溫范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對(duì)印度谷螟的生長發(fā)育均有顯著影響，且整體上呈現(xiàn)發(fā)育歷期延長的趨勢(shì)，這一結(jié)果與先前研究報(bào)道一致[10-11]。在 27 ℃條件下，對(duì)照組（MH/CK）試蟲卵至成蟲的發(fā)育歷期為63.20 d，2% HH/Bt糙米粉飼喂的實(shí)驗(yàn)組試蟲延長為75.60 d。各發(fā)育階段試蟲的發(fā)育歷期為：對(duì)照組一齡、二齡、三齡和四齡幼蟲發(fā)育歷期均約為5 d左右，而實(shí)驗(yàn)組則均延長為8 d左右；對(duì)照組五齡幼蟲發(fā)育歷期為 7.55 d，實(shí)驗(yàn)組則延長為10.22 d；研究還發(fā)現(xiàn)，六齡幼蟲發(fā)育歷期縮短，對(duì)照組為16.47 d，實(shí)驗(yàn)組則縮短為12.83 d；化蛹后，對(duì)照組蛹期和成蟲期的發(fā)育歷期分別為 8.21和 7.06 d，實(shí)驗(yàn)組蛹期和成蟲期的發(fā)育歷期則分別延長為9.06和8.50 d（表2）。

根據(jù)C. de A. E. Gasparin提出的有效積溫法則，作為變溫動(dòng)物的昆蟲，其生長發(fā)育須從外界（食物和環(huán)境）獲取一定的熱量，且存在發(fā)育閾溫度和最適發(fā)育溫度。不同模擬溫度條件下，取食MH/CK和2% HH/Bt糙米粉的印度谷螟卵發(fā)育至成蟲所需總時(shí)間見圖2。在21～36 ℃條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組試蟲均能完成生長發(fā)育，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均在 30 ℃條件下發(fā)育歷期達(dá)到最小值（分別為53.00 d和67.73 d）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，以2% HH/Bt和MH/CK糙米為飼料的印度谷螟在各溫度下發(fā)育歷期差異均極顯著（P<0.05）。

表1 不同含量的轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)印度谷螟的致死率統(tǒng)計(jì) %

表2 不同溫度下轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對(duì)印度谷螟生長發(fā)育的影響

圖2 轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)印度谷螟生長發(fā)育（卵至成蟲）的影響

2.3 各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關(guān)系的模擬

昆蟲的生長發(fā)育不但需要在一定的溫度范圍內(nèi)，且在這個(gè)適宜昆蟲生長發(fā)育的溫度閾值內(nèi)，昆蟲的生長發(fā)育速度同樣受到溫度的影響。印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率表明，其生長發(fā)育速率與溫度的關(guān)系是非線性的，在21～30 ℃其趨勢(shì)為類似對(duì)數(shù)增長，在高于 30 ℃之后，該曲線迅速下降，在最高發(fā)育速度的兩側(cè)曲線并不對(duì)稱。依據(jù) Briere等[9]非線性模型進(jìn)行回歸方程擬合，印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關(guān)系模型參數(shù)如表 3所示：印度谷螟的發(fā)育起點(diǎn)溫度（T0）為 7.40～15.94 ℃，其中，卵、六齡期、蛹的起始溫度分別為15.15、9.92和7.40 ℃，表明印度谷螟六齡幼蟲和蛹對(duì)低溫的耐受能力很強(qiáng)；印度谷螟發(fā)育最高溫度（TL）在 37.60～44.11 ℃，其中，卵孵化的溫度上限為 38.71 ℃，本研究在 39 ℃下的印度谷螟卵未能發(fā)育也證實(shí)了這一推斷結(jié)果。各蟲態(tài)的發(fā)育速率R(T)與溫度T間的擬合非線性曲線模型見圖3。

表3 印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關(guān)系模型參數(shù)

2.4 轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)印度谷螟發(fā)育速率的影響

印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關(guān)系的非線性方程各參數(shù)見表4。以2% HH/Bt糙米粉為食的印度谷螟發(fā)育起點(diǎn)溫度（T0）為4.90～17.36 ℃，其中卵孵化的起始溫度為 15.13 ℃，六齡幼蟲和蛹對(duì)低溫的耐受能力最強(qiáng)；發(fā)育最高溫度（TL）上限為 37.72～40.33 ℃，其中卵孵化的溫度上限為38.96 ℃。據(jù)此推斷，印度谷螟在轉(zhuǎn)Bt基因稻谷為飼料的生長環(huán)境中的適應(yīng)性要高于對(duì)照組，與先前轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)鱗翅目倉儲(chǔ)害蟲生長發(fā)育影響結(jié)果相同[12-14]。2% HH/Bt糙米粉飼喂印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率R(T)與溫度T間的擬合非線性曲線模型見圖4。

圖3 印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關(guān)系模擬

表4 印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關(guān)系模型參數(shù)（2% HH/Bt）

通過以上表3與表4數(shù)據(jù)以及印度谷螟各蟲態(tài)3個(gè)參數(shù)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，取食轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷并沒有顯著改變印度谷螟最高發(fā)育溫度，但印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育最低溫度有所增加，這可能是低溫和Bt蛋白雙重作用的結(jié)果。

轉(zhuǎn)Bt基因稻谷的開發(fā)是抵抗田間害蟲的有效手段[15-18]，同時(shí)轉(zhuǎn)基因稻谷的產(chǎn)后面臨的倉儲(chǔ)環(huán)節(jié)引起諸多糧食儲(chǔ)藏研究人員的諸多關(guān)注。趙文娟[10]用轉(zhuǎn)Cry1Ac+SCK稻谷飼喂印度谷螟的研究表明實(shí)驗(yàn)組印度谷螟存活率、發(fā)育歷期分別為40.8%、62.2 d，而對(duì)照組分別為75.2%、53.0 d，兩者存在顯著差異。蔣海燕等[11]通過配制不同比例轉(zhuǎn)Bt基因稻谷人工飼料測(cè)定其對(duì)1～3齡幼蟲在72 h內(nèi)的急性毒力實(shí)驗(yàn)表明，取食含10%、30%、50%和70%轉(zhuǎn)基因稻谷粉飼料72 h后的印度谷螟初孵化幼蟲的死亡率分別為 29.30%、48.50%、54.75%和71.61%。轉(zhuǎn)基因稻谷開發(fā)時(shí)，盡管選取的Bt基因有所不同，但獲得的轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)鱗翅目昆蟲據(jù)均有良好殺滅作用，本文以及類似研究均表明，轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)鱗翅目?jī)?chǔ)糧害蟲仍表現(xiàn)出良好的抗蟲性。

圖4 印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關(guān)系模擬（2% HH/Bt）

目前關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)儲(chǔ)糧害蟲生長發(fā)育的研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲稻谷對(duì)印度谷螟、麥蛾和米蛾等鱗翅目害蟲顯示出較高的抗蟲性，在存活率、發(fā)育歷期等生物學(xué)指標(biāo)上與對(duì)照組都存在差異性。Mcgaughey[19]首次報(bào)道了印度谷螟在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)Bt產(chǎn)生抗性。稻谷的儲(chǔ)藏是一個(gè)長期持續(xù)的過程，在Bt蛋白的長期脅迫下，將導(dǎo)致害蟲種群中抗性基因及個(gè)體的出現(xiàn)或增加，嚴(yán)重的甚至?xí)霈F(xiàn)“超級(jí)害蟲”，這是一個(gè)重要的生態(tài)安全問題，糧庫害蟲管理將面臨新的挑戰(zhàn)。為此，我們還對(duì)喂食轉(zhuǎn)基因稻谷后的印度谷螟差異表達(dá)基因以及抗氧化酶活性進(jìn)行研究[20-21]，這對(duì)于加強(qiáng)儲(chǔ)糧害蟲抗性管理及抗性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，為轉(zhuǎn)基因稻谷的安全儲(chǔ)藏提供指導(dǎo)，是十分必要且有意義的。

3 結(jié)論

利用轉(zhuǎn)Bt基因稻谷糙米粉（HH/Bt）飼養(yǎng)印度谷螟，統(tǒng)計(jì)不同溫度條件下各蟲態(tài)的發(fā)育歷期和發(fā)育速度，并與非轉(zhuǎn)基因稻谷糙米粉（MH/CK）飼養(yǎng)的對(duì)照組進(jìn)行比較分析，得到如下結(jié)論：

（1）溫度能夠顯著影響印度谷螟各蟲態(tài)的發(fā)育歷期和發(fā)育速度，印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率R（T）與溫度T的非線性模型擬合曲線顯示，該蟲發(fā)育起點(diǎn)溫度（T0）為7.40～15.94 ℃，其中，卵孵化的起始溫度和最高溫度分別為 15.15 ℃、38.71 ℃。

（2）將印度谷螟卵接入到完全轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的飼料中，孵化的幼蟲全部死亡，這表明儲(chǔ)藏期內(nèi)轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)糧倉印度谷螟具有一定的致死作用。

（3）以轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（2%HH/Bt）飼喂的印度谷螟幼蟲生長發(fā)育所需時(shí)間比對(duì)照稻谷（MH/CK）顯著增加，說明在亞致死劑量以下時(shí)，Bt蛋白可以減緩印度谷螟生長發(fā)育速率。

（4）取食含轉(zhuǎn)Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷飼料的印度谷螟發(fā)育起點(diǎn)溫度（T0）為4.90～17.36 ℃，溫度范圍較對(duì)照組有所擴(kuò)大，而卵孵化的起始溫度和最高溫度則分別為 15.13 ℃、38.96 ℃，無明顯變化。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。