慢性心力衰竭與IL-17A基因rs2275913、rs4711998位點多態(tài)性的關(guān)系

吳薇，李寧，李克研

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，發(fā)生心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，包括心肌細胞死亡、纖維化和電生理重構(gòu)[1-2]。免疫激活和炎癥參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展，表現(xiàn)為多種炎癥因子循環(huán)水平升高[3-4]。IL-17 由CD4+T 細胞分泌，通過招募免疫細胞參與炎癥反應(yīng)的放大[5]。基因遺傳變異可以改變基因的分子特征，改變某些疾病的風(fēng)險。編碼IL-17A基因位于6 號染色體（6p12）上，相關(guān)研究已證實人類一些疾病發(fā)病風(fēng)險與IL-17A基因多態(tài)性之間存在相關(guān)性，如多發(fā)性硬化癥、胃癌[6-8]。然而，對于IL-17A基因多態(tài)性在CHF 發(fā)生、發(fā)展中起到的作用研究甚少。本文旨在探討CHF 發(fā)病與IL-17Ars2275913（G-197A）、rs4711998（G-197A） 位點多態(tài)性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2019年3月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科的就診的CHF 患者131 例作為CHF 組。其中，男性75 例，女性56 例；平均年齡（57±48）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHF 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Framingham 標(biāo)準(zhǔn)[9]，心功能NYHA 分級Ⅱ～Ⅳ級，超聲心動圖檢測LVEF＜45%；②年齡≥18 歲；③CHF病史≥3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①4周之內(nèi)發(fā)生過心肌梗死；②急性心力衰竭；③合并嚴重心臟瓣膜病變；④嚴重肝、腎功能損害及血液系統(tǒng)疾病；⑤嚴重貧血、甲狀腺功能亢進癥；⑥風(fēng)濕性心臟病；⑦惡性腫瘤；⑧嚴重的急性感染或代謝紊亂。選取同期本院健康體檢者80 例作為對照組，其性別、年齡均與CHF 組相匹配。對照組經(jīng)體檢后排除心血管疾病、嚴重肝或腎疾病、甲狀腺疾病、糖尿病。所有研究對象之間無血緣關(guān)系，且參與個體均已簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 基因型判定

1.2.1 標(biāo)本采集和基因組DNA 的提取受試者抽取空腹外周靜脈血3 ml，將標(biāo)本置于EDTA 抗凝管中并于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用全血基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照說明書進行操作，DNA 樣本提取后置入-20℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms,SNP）鑒定PCR 引物序列由北京博邁德生物有限公司合成。IL-17A基因rs2275913 正向引物：5'-GCAGCTCTGCTCAGCTTCTAA-3'（21 bp），反向引物：5'-TTCAGGGGTGACACCATTTT-3'（20 bp）。rs4711998正向引物：5'-TTACACTCCAGCCATTGAG TTG-3'（22 bp），反向引物：5'-TGAAAATGGGGAT AGAGACTGG-3'（22 bp）。目的基因擴增PCR 擴增反應(yīng)體系為25 ml，其中含有8μl DNA 提取物，正反向引物各1μl，2×Reaction Mix 12.5μl，Golden DNA Polymerase 0.25μl，剩余加入ddH2O。擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，于4℃保存。用2.5%瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色將PCR 產(chǎn)物進行電泳，于紫外線透射儀下觀察是否擴增成功。IL-17A基因rs2275913（G-197A）位點應(yīng)用內(nèi)切酶EcoNI，并在37℃孵育15 min，rs4711998（G-197A）位點應(yīng)用內(nèi)切酶TaqI并在65℃孵育1 h，用3%瓊脂糖凝膠將酶切產(chǎn)物進行電泳，在紫外燈照射下觀察并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件，患者經(jīng)χ2擬合優(yōu)度檢驗是否符合Hardy-Weinberg（哈德溫伯格）平衡定律，以P＞0.05 為符合Hardy-Weinberg 平衡，表示研究樣本具有群體代表性[10]?；蛐秃偷任换蝾l率用基因頻率計數(shù)法比較，用χ2檢驗兩組間基因型和等位基因頻率分布?；蛐团cCHF 的發(fā)病因素比值比及95% CI 采用非條件Logistic 回歸分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A基因rs2275913、rs4711998位點PCR產(chǎn)物及基因型判定

PCR 產(chǎn)物電泳后在紫外燈下觀察，可見PCR 產(chǎn)物中分別有155 bp 和359 bp 大小的條帶（見圖1、2）。產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶酶切，于3%瓊脂糖凝膠電泳，7 號樣本分別為155 bp、87 bp 和68 bp，基因型為AG；1 號和2 號樣本2 條帶，分別為87 bp 和68 bp，基因型為GG；3 號和5 號樣本僅有155 bp 條帶，基因型為AA（見圖3）。5 號樣本分別為359 bp、206 bp 和153 bp，基因型為AG；1 號和2 號樣本2 條帶，分別為206 bp和153 bp，基因型為GG；3 號和4 號樣本僅有359 bp條帶，基因型為AA（見圖4）。

圖1 IL-17A 基因rs2275913 PCR 產(chǎn)物

圖2 IL-17A 基因rs4711998 PCR 產(chǎn)物

圖3 IL-17A 基因rs2275913 PCR 產(chǎn)物酶切分型鑒定

圖4 IL-17A 基因rs4711998 PCR 產(chǎn)物酶切分型鑒定

2.2 CHF 組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位點與對照組實際、預(yù)期基因頻率比較

CHF 組IL-17A基因rs2275913 實際與預(yù)期基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組實際與預(yù)期基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明研究樣本具有群體代表性。CHF 組IL-17A基因rs4711998 實際與預(yù)期基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組實際與預(yù)期基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明研究樣本具有群體代表性。見表1。

2.3 兩組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998位點各基因型及等位基因頻率分布比較

兩組IL-17A基因rs2275913 位點AA、AG及GG 基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且其A、G 等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組IL-17A基因rs4711998 位點AA、AG 及GG 基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且其A、G 等位基因頻率分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位點SNP與CHF的Logistic回歸分析

采用非條件二分類反應(yīng)變量的Logistic 回歸分析，自變量為各組基因型，因變量為是否患有心力衰竭，以GG 基因型為參照，可見IL-17A基因rs2275913 位點攜帶AA 基因型的個體患CHF 的風(fēng)險是攜帶GG 基因型個體的4.410 倍。CHF 組IL-17A基因rs2275913（G-197A）位點攜帶A 等位基因頻率高于對照組（P＜0.05）。未發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs4711998 位點SNP 與CHF 發(fā)病有關(guān)（均P＞0.05）。見表3。

表1 CHF 組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點與對照組實際、預(yù)期基因頻率的比較 %

表2 兩組IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點各基因型及等位基因頻率分布比較 例（%）

表3 IL-17A 基因rs2275913、rs4711998 位點SNP 與CHF 的Logistic 回歸分析參數(shù) 例（%）

3 討論

IL-17A 是一種多效細胞因子，一方面通過募集中性粒細胞與Th17 分泌的其他細胞因子（如IL-6 及腫瘤壞死因子）協(xié)同誘導(dǎo)炎癥；另一方面其可以產(chǎn)生炎性介質(zhì)，如刺激上皮細胞和內(nèi)皮細胞等[11-14]。IL-17A 在多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用，裴芳等[15]研究證實IL-17A基因rs2275913 位點A 等位基因是病毒性心肌炎的易感基因。同樣，唐輝等[16]研究證實IL-17A基因SNP 與擴張型心肌病的遺傳易感性有關(guān)。SHUANG 等[17]發(fā)現(xiàn)rs2275913 位點的AA 基因型及A 等位基因的個體與患冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的風(fēng)險有關(guān)聯(lián)。目前，有研究報道IL-17A基因rs4711998 位點與多種疾病的相關(guān)性，如與哮喘、巨細胞動脈炎的發(fā)病相關(guān)[18-19]。然而，還沒有證據(jù)支持其在心力衰竭中的作用。哈德溫伯格平衡定律應(yīng)用于理想群體，筆者從理想群體出發(fā)并使理論分析結(jié)果接近于客觀真實群體的情況，從而獲得真實群體遺傳的一般規(guī)律[10]。本研究結(jié)果顯示，IL-17A基因rs2275913、rs4711998 位點AA、AG 和GG 基因型在CHF 組和對照組中實際與預(yù)期基因頻率分布比較無差異，表明兩組研究樣本均具有群體代表性。本研究顯示，大部分CHF 患者IL-17A基因rs2275913 位點基因型多為AG 或AA，且攜帶A 等位基因的頻率明顯高于對照組，其患病風(fēng)險也顯著增加。本研究結(jié)果提示CHF 的發(fā)病與IL-17A基因rs2275913 位點SNP 相關(guān)，這表明G-197A 的變化導(dǎo)致IL-17A基因表達，擾亂了調(diào)節(jié)生物效應(yīng)的機制，致使免疫狀態(tài)發(fā)生改變并在多種刺激誘導(dǎo)下發(fā)生心肌損害、心肌纖維化及心室重構(gòu)。這與SANDIP 等[20]報道的結(jié)果不一致，造成這種差異的潛在原因是被調(diào)查人群中不同種族、不同地區(qū)間突變的差異。

綜上所述，IL-17A基因rs2275913 位點多態(tài)性可能與CHF 的發(fā)病有關(guān)，而且該位點可能影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達。然而，這項研究有幾個局限性。首先，本研究由于樣本量偏少，其次特定區(qū)域的抽樣不能反映其他區(qū)域的情況。因此本研究仍需進一步擴大樣本量，進行多中心、多群體及多位點的前瞻性研究來驗證IL-17A基因與CHF 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。