枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒對稚鯢生長及免疫指標的影響試驗

文/周韶輝 解宜興 周先文 王曉清2, 陳家法

隨機選取體質(zhì)健康、體重為3g左右剛開口的稚鯢，每天分別以0.05%、0.10%、0.20%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液進行拌料投喂試驗，測定各組大鯢的生長及攝食指標、血液生理生化指標與血清抗氧化酶及非特異性免疫指標，結(jié)果表明以0.10%、0.20%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒溶水拌料投喂稚鯢，不僅能提升稚鯢的營養(yǎng)水平及生長性能，還能促進其抗氧化酶及非特異性免疫活性的提升，降低其肝功能損傷的風(fēng)險，從而有效提升稚鯢疾病抵抗能力及存活率。

一、材料與方法

（一）試驗地點

試驗地點在湖南省大鯢救護中心，該中心是全國最早、規(guī)模最大的大鯢救護機構(gòu)，也是湖南乃至全國大鯢種質(zhì)保存最為純正和最全面的基因庫。

（二）試驗時間

2019年01月～2019年06月，試驗期共計180天。

（三）試驗材料

枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒為北京一公司生產(chǎn)，為復(fù)方制劑，配方組成見表1。試驗用大鯢由湖南省大鯢救護中心提供，為規(guī)格3g左右的稚鯢。

（四）試驗內(nèi)容

根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計單因素試驗考察以不同添加量枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂，對稚鯢生長指標及非特異性免疫指標的影響。

1. 試驗大鯢的選擇與分組

隨機選取48尾剛開口的稚鯢，30日齡、體質(zhì)健康、體重為3g左右。分為對照組、枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)4尾大鯢。對照組：每天投喂基礎(chǔ)餌料；低劑量組：每天投喂0.05%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液拌料；中劑量組：每天投喂0.10%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液拌料；高劑量組：每天投喂0.20%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液拌料。

表1 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒配方組成

2.試驗餌料組成

根據(jù)稚鯢階段生長需要，基礎(chǔ)餌料配方為100%紅蟲。

3.生長及攝食指標的測定

試驗期間，記錄試驗大鯢的初始體重及試驗結(jié)束時的體重、每日投餌量及殘餌量，計算試驗期內(nèi)大鯢體重增加量、平均增重率、餌料系數(shù)、特定生長率。具體計算公式如下：

體重增加量=W2-W1；

平均增重率=[（W2-W1）/W1]/n×100%；

餌料系數(shù)=（F1-F2）/（W2-W1）；

特定生長率=（lnW2-lnW1）/t×100%

公式中，W1為大鯢的初始總重、W2為試驗結(jié)束時大鯢的總重，n為各個重復(fù)的樣本數(shù)，F(xiàn)1為總投餌量、F2為總殘餌量，t為實驗總天數(shù)。

4.血液生理指標測定

試驗結(jié)束時，對所有試驗大鯢以無菌注射器進行尾靜脈采血，并將血樣注入到添加抗凝劑的采血管中，將血樣低溫保存，送至湖南張家界市人民醫(yī)院實驗室以全自動生化儀進行檢測，主要測定白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（Hb）及血小板總數(shù)（Plt）等血液生理指標。

5.血液生化指標的測定

試驗結(jié)束時，對所有試驗大鯢以無菌注射器進行尾靜脈采血，并將血樣注入到添加抗凝劑的采血管中，將血樣低溫保存，送至湖南張家界市人民醫(yī)院以全自動生化儀進行檢測，主要測定總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL-K）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）、甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）等血液生化指標。

6.血清抗氧化酶和非特異性免疫指標測定

試驗結(jié)束時，對所有試驗大鯢以無菌注射器進行尾靜脈采血，采集到的血液于4℃靜置2h后，再以4000r/min離心10min，取上清液，即為血清。分別以試劑盒測定血清的酸性磷酸酶（ACP）、過氧化氫酶（CAT）及SOD（超氧化物歧化酶）等為抗氧化酶和非特異性免疫指標。具體方法如下：

（1）ACP的測定采用酸性磷酸酶試劑盒，其活力單位定義為：100mL血清或1g組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1mg酚為一個金氏單位；

（2）CAT的測定采用過氧化氫酶測定試劑盒，其活力單位定義為：1mL或1mg組織每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個活力單位；

（3）SOD的測定采用總SOD試劑盒，以血清為樣品，活力單位定義為1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量。

7.發(fā)病率及成活率統(tǒng)計

試驗期間密切觀察各組大鯢的生長情況，如發(fā)生病害感染應(yīng)及時采取隔離措施，并對病鯢進行疾病診斷及治療。試驗結(jié)束時，統(tǒng)計各組大鯢各類病害發(fā)生情況、死亡數(shù)，計算發(fā)病率、死亡率及成活率。具體計算公式如下：

發(fā)病率= 發(fā)病尾數(shù)/ 總尾數(shù)×100%；

死亡率= 死亡尾數(shù)/ 總尾數(shù)×100%；

成活率=成活尾數(shù)/總尾數(shù)×100%

（五）飼養(yǎng)管理

將試驗大鯢養(yǎng)殖于陰涼避光處，養(yǎng)殖水源為寶峰湖湖水，水溫保持在20℃～25℃之間，溶解氧＞6.0mg/L，pH值為6.5～7.5。餌料經(jīng)消毒后于每日18:00投喂，次日08:00撈出殘餌，分別記錄每日各組的投餌量與殘餌量。

（六）統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件處理后，用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

二、結(jié)果與分析

（一）枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢生長性能的影響

由統(tǒng)計分析可知（表2），試驗結(jié)束時，三個試驗組稚鯢終末體重、平均增重率、特定生長率均顯著高于對照組（P＜0.05），說明枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢的生長具有積極促進作用；高劑量組終末體重、平均增長率、特定生長率顯著高于中、低劑量組（P＜0.05），說明該劑量的枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢生長性能具有更好地促進效果；三個試驗組餌料系數(shù)均顯著低于對照組。

（二）枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血液生理指標的影響

由統(tǒng)計分析可知（表3），試驗結(jié)束時，對照組稚鯢血液白細胞數(shù)（WBC）顯著高于三個試驗組（P＜0.05），提示對照組稚鯢可能發(fā)生感染性疾病；對照組稚鯢血液紅細胞數(shù)（RBC）及血紅蛋白（Hb）顯著低于三個試驗組（P＜0.05）；對照組稚鯢血小板總數(shù)（Plt）極顯著高于三個試驗組（P＜0.01），提示對照組稚鯢全部或部分感染化膿性疾病。

（三）枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血液生化指標的影響

由統(tǒng)計分析可知（表4），試驗結(jié)束時，三個試驗組稚鯢血液中的總蛋白（TP）含量顯著高于對照組（P＜0.05），但三個試驗組間無顯著性差異（P＞0.05）；三個試驗組稚鯢血液中白蛋白（ALB）含量顯著高于對照組（P＜0.05），且中劑量組及高劑量組稚鯢血液中白蛋白（ALB）含量顯著高于低劑量組（P＜0.05）；三個試驗組稚鯢血液中總膽紅素（TBIL-K）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）含量均顯著低于對照組（P＜0.05），但三個試驗組間無顯著性差異（P＞0.05）；四組稚鯢血液中甘油三酯（TG）及膽固醇（CHOL）含量均無顯著性差異（P＞0.05）；三個試驗組稚鯢血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及堿性磷酸酶（ALP）含量均極顯著低于對照組（P＜0.01）；三個試驗組稚鯢血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。

（四）枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血清抗氧化酶和非特異性免疫指標的影響

由統(tǒng)計分析可知（表5），試驗結(jié)束時，中劑量組及高劑量組稚鯢血清中酸性磷酸酶（ACP）均顯著高于低劑量及對照組（P＜0.05）；三個試驗組稚鯢血清中過氧化氫酶（CAT）均顯著高于對照組；中劑量組及高劑量組稚鯢血清中超氧化物歧化酶（SOD）均顯著高于低劑量組及對照組。

表2 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢生長性能的影響

表3 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血液生理指標的影響

表4 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血液生化指標的影響

表5 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢血清抗氧化酶和非特異性免疫指標的影響

表6 枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢發(fā)病率及成活率的影響

（五）枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒拌料投喂對稚鯢發(fā)病率及成活率的影響

由統(tǒng)計分析可知（表6），試驗結(jié)束時，對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組稚鯢成活率分別為83.33%、91.66%、100.00%、100.00%；對照組發(fā)病率為16.67%，中劑量組及高劑量組發(fā)病率均為0；低劑量組死亡率為8.34%，但解剖后尚未發(fā)現(xiàn)明顯疾病癥狀，體質(zhì)健康、精子卵子質(zhì)量好的親本產(chǎn)生的后代個體健康，抗病力強，成活率高，否則體質(zhì)弱，易發(fā)病，因此推測死因可能與遺傳因素有關(guān)。經(jīng)診斷，對照組患病稚鯢所患疾病均為腹水病。

三、討論

稚鯢為大鯢變態(tài)發(fā)育過程中由受精卵孵化出膜，從利用卵黃作為營養(yǎng)到開口主動攝食階段的大鯢。本階段大鯢體弱性嬌，抗逆性差，養(yǎng)殖過程中極易發(fā)生病害感染，從而導(dǎo)致其生長停滯甚至死亡。

枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒為復(fù)方制劑，其主要成分包括枯草桿菌、屎腸球菌、維生素C、氧化鋅等。臨床研究表明，本品可直接補充正常生理菌叢，抑制致病菌，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，抑制腸源性毒素的產(chǎn)生和吸收，從而達到調(diào)整腸道內(nèi)菌群的目的。此外，本品還含有機體發(fā)育所必須的維生素及微量元素，可有效補充因消化不良或腹瀉所致的維生素及微量元素缺乏。

本研究結(jié)果表明，每天以0.10%或0.20%枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液拌料投喂稚鯢，能降低稚鯢患病的風(fēng)險，從而提升其生長性能及存活率；血液生化指標檢測結(jié)果顯示，以枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒溶水拌料投喂稚鯢能顯著提升其營養(yǎng)水平、降低其肝功能損傷風(fēng)險；血清抗氧化酶和非特異性免疫指標檢測結(jié)果顯示，以枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒溶水拌料投喂稚鯢能顯著提升稚鯢抗氧化酶及非特異性免疫活性。

試驗期間，對照組部分稚鯢出現(xiàn)食量下降、體重減輕、反應(yīng)遲鈍等癥狀，以手觸摸其頭、腹部有積水感，經(jīng)診斷初步判定為腹水病。對病鯢采取隔離飼養(yǎng)并將原養(yǎng)殖池以1.00mg/L濃度的漂白粉進行消毒，使其口服恩諾沙星（劑量為每公斤大鯢100mg/天）進行治療，效果不理想，病鯢病勢發(fā)展迅速，于3日～5日內(nèi)陸續(xù)死亡。對病鯢進行解剖后發(fā)現(xiàn)其腹腔積水嚴重，胃腸無內(nèi)容物，消化道充血，肝組織中見大量炎性細胞浸潤，確診為腹水病。此外，試驗期間低劑量組稚鯢出現(xiàn)死亡1例，該稚鯢死亡前未發(fā)現(xiàn)明顯異樣，經(jīng)解剖亦未明確致死原因，推測可能與遺傳因素有關(guān)。稚鯢普遍體弱性嬌，抗逆性差，養(yǎng)殖過程中極易發(fā)生病害感染，從而導(dǎo)致其生長停滯甚至死亡。本試驗對照組與試驗組發(fā)病率、成活率的差異反映出枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒溶水拌料投喂稚鯢能有效提升其疾病抗性。

四、結(jié)論

綜上所述，研究證明以0.10%、0.20%的枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒水溶液拌料投喂稚鯢，不僅能提升稚鯢的營養(yǎng)水平及生長性能、還能促進其抗氧化酶及非特異性免疫活性的提升，降低其肝功能損傷的風(fēng)險，從而有效提升其疾病抵抗能力及存活率。但目前關(guān)于枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究仍鮮見報道，其作用機理、使用量及給藥方式還有待進一步研究。