神經(jīng)肌肉電刺激預(yù)防廢用性肌萎縮作用機(jī)制及研究進(jìn)展

楊佳佳，徐義明，白躍宏

骨骼肌的生長(zhǎng)和維持依賴于對(duì)肌肉活動(dòng)與機(jī)械負(fù)荷的刺激反應(yīng)，肌肉活動(dòng)減少或機(jī)械負(fù)荷減少都會(huì)導(dǎo)致廢用性肌萎縮，如因疾病長(zhǎng)期臥床、骨折外傷石膏固定及其他原因需肢體制動(dòng)等均會(huì)造成廢用性肌萎縮，其主要特征是肌肉蛋白合成代謝下降，分解代謝增強(qiáng)，主要表現(xiàn)有肌肉濕重減少、肌纖維橫截面積減少、慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)換、肌肉力量下降等［1-3］。

神經(jīng)肌肉電刺激作為肌萎縮的一種常用物理治療手段，可誘導(dǎo)骨骼肌非自主收縮，替代廢用狀態(tài)下肌肉活動(dòng)，限制或逆轉(zhuǎn)廢用狀態(tài)下肌萎縮進(jìn)程的發(fā)生［4］。神經(jīng)肌肉電刺激誘導(dǎo)的收縮使肌肉容積、橫截面積增加、蛋白質(zhì)合成增加等［5-6］。但利用神經(jīng)肌肉電刺激預(yù)防廢用性肌萎縮的機(jī)制尚不明確，故對(duì)于最佳刺激方案，如刺激頻率、作用時(shí)間及周期的選擇，目前亦無統(tǒng)一的說法，了解神經(jīng)肌肉電刺激在預(yù)防肌萎縮中的作用機(jī)制可為臨床診療策略制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本文擬從廢用性肌萎縮發(fā)生機(jī)制以及神經(jīng)肌肉電刺激作用機(jī)制展開論述。

1 促進(jìn)肌肉蛋白合成

1.1 Akt 相關(guān)信號(hào)通路 激酶Akt(又稱蛋白激酶B)是骨骼肌生長(zhǎng)相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要成分，Akt 可活化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）調(diào)控肌蛋白質(zhì)合成，Akt 信號(hào)傳導(dǎo)能夠使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glucose Transporter 4，GLUT4）易位到細(xì)胞膜，增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，從而對(duì)抗肌萎縮[7]。在后肢懸吊的廢用性肌萎縮試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Akt/mTOR 信號(hào)通路是被抑制的[8]。研究發(fā)現(xiàn)電刺激可使肌微管細(xì)胞的Akt，GLUT4 激活和表達(dá)上調(diào)[9]。另一方面，Akt 通過調(diào)控叉頭盒O（Forkhead box O，F(xiàn)OXO）的磷酸化水平調(diào)節(jié)肌蛋白降解過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過給予后肢懸吊14d 的大鼠100Hz 的神經(jīng)肌肉電刺激，觀察到Akt 活化、FoxO3a磷酸化水平上升，比目魚肌萎縮情況得到緩解[10]。Dirks 等[11]對(duì)重癥臥床肌萎縮病人神經(jīng)肌肉電刺激的研究中，通過對(duì)6 名患者采取自身雙側(cè)股四頭肌刺激對(duì)照的方式，予以側(cè)股四頭肌頻率為100Hz 的神經(jīng)肌肉電刺激，每天2 次，每次30min，持續(xù)7±1d，對(duì)照組不予神經(jīng)肌肉電刺激，但仍安放電極，結(jié)果表明：對(duì)照組肌肉橫截面積減少了20%，電刺激組未檢測(cè)到明顯肌萎縮，電刺激組FOXO1 的信使RNA（Messager RNA，mRNA）水平下降，mTOR 磷酸化水平增高。上述研究表明Akt 相關(guān)信號(hào)通路在廢用性肌萎縮中扮演著重要角色，神經(jīng)肌肉電刺激能通過激活蛋白合成相關(guān)的Akt/mTOR 途徑同時(shí)抑制Akt/FOXO 蛋白降解途徑來緩解廢用性肌萎縮。

1.2 MAPK 信號(hào)通路 哺乳動(dòng)物絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）家族由幾種信號(hào)分子包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（CJun Amino-terminal Kinase，JNK）及p38 組成，他們通過調(diào)控基因表達(dá)來調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，ERK 和p38 也通過絲裂原和應(yīng)激激活激酶的磷酸化來增加帽狀mRNA 的翻譯，進(jìn)而增加肌纖維蛋白的合成[12]。在各種誘導(dǎo)因素（包括神經(jīng)肌肉電刺激，負(fù)重，阻抗運(yùn)動(dòng)和耐力性活動(dòng)）作用下，均可檢測(cè)到激酶（JNK、ERK、P38）的激活[13]。在大鼠的廢用性肌萎縮模型中，JNK，P38 和ERK 的表達(dá)降低，而通過頻率為30Hz，每天30min，持續(xù)30d 的神經(jīng)肌肉電刺激后，肌纖維中JNK，ERK，P38 的表達(dá)上調(diào)，肌萎縮得到緩解，說明神經(jīng)肌肉電刺激可通過激活MAPK 信號(hào)通路，延緩廢用性肌萎縮的發(fā)生[14]。

2 抑制肌肉蛋白水解

2.1 抑制泛素蛋白水解相關(guān)途徑 骨骼肌萎縮發(fā)生時(shí)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)調(diào)蛋白水解分子程序，對(duì)靶蛋白進(jìn)行泛素化，完成蛋白質(zhì)的降解過程。其中，泛素連接酶E3 對(duì)靶蛋白的特異識(shí)別是蛋白降解的關(guān)鍵。肌肉萎縮盒F 蛋白（Muscle Atrophy F-boX，MAFbx）和肌環(huán)狀指蛋白1（Muscle RING Finger1，MuRF1）是兩種肌肉特異性表達(dá)的泛素連接酶E3，MAFbx 與MuRF1 的mRNA 水平在肌萎縮早期都明顯上升，可能與肌萎縮的啟動(dòng)有關(guān)[15]。上述Dirks M L等在健康志愿者的肌萎縮模型的研究中，通過5d 的單側(cè)下肢制動(dòng)建立短期肌萎縮模型，實(shí)驗(yàn)組（n=12）予100Hz，每天2 次，每次40min 的神經(jīng)肌肉電刺激治療，對(duì)照組（n=12）不予電刺激，與對(duì)照組MAFbx 和MuRF1 升高相比，實(shí)驗(yàn)組MAFbx 和MuRF1 無明顯變化，表明電刺激可阻止肌萎縮連接酶的表達(dá)而緩解肌肉廢用性肌萎縮［16］。但Dirks 等［11］隨后在重癥患者肌萎縮的研究中，肌萎縮患者對(duì)照組與電刺激組MAFbx 和MuRF1 表達(dá)均增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異。兩次試驗(yàn)的結(jié)果的差異可能與廢用性肌萎縮的模型不同有關(guān)，故盡管泛素蛋白水解系統(tǒng)在廢用性肌萎縮中有重要作用，但電刺激在泛素蛋白水解系統(tǒng)中的作用尚需更進(jìn)一步的研究。

2.2 阻斷鈣蛋白酶活性 泛素蛋白酶體系統(tǒng)不能直接降解完整的肌原纖維內(nèi)蛋白質(zhì)，需要鈣蛋白酶切割肌巨蛋白、伴肌動(dòng)蛋白等使肌原纖維解分解[17]。研究表明，阻斷鈣蛋白酶活性可抑制泛素蛋白酶體途徑活化，保留肌肉蛋白合成代謝信號(hào)，減少?gòu)U用性骨骼肌萎縮[18]。研究中，將大鼠后肢懸吊14d 建立肌萎縮模型，實(shí)驗(yàn)組予以脛骨前肌100Hz 神經(jīng)肌肉電刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比空白對(duì)照組，后肢懸吊后的鈣蛋白酶2 的表達(dá)僅輕度升高，且電刺激未使鈣蛋白酶的表達(dá)發(fā)生明顯變化，表明后肢懸吊的廢用性肌萎縮模型中，神經(jīng)肌肉電刺激脛骨前肌時(shí)可能并非通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶的表達(dá)緩解廢用性肌萎縮[19]。

3 阻止肌生成抑制蛋白表達(dá)

肌生成抑制蛋白是一種肌生成負(fù)向調(diào)節(jié)因子，其通過阻滯成肌調(diào)節(jié)因子使肌生成基因表達(dá)受阻［20］，研究表明肌生成抑制蛋白明顯促進(jìn)廢用性骨骼肌萎縮［21］。在Dirks 等［16］的試驗(yàn)中檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組肌生成抑制蛋白mRNA 未發(fā)生改變，肌肉橫截面積及肌肉濕重均未明顯下降，而對(duì)照組肌生成抑制蛋白mRNA 表達(dá)上升。故阻止肌生成抑制蛋白的表達(dá)是神經(jīng)肌肉電刺激緩解肌萎縮的可能機(jī)制之一。

4 減少衛(wèi)星細(xì)胞凋亡

衛(wèi)星細(xì)胞作為一種替補(bǔ)細(xì)胞，在骨骼肌損傷后活化募集，分化為成肌細(xì)胞，對(duì)肌纖維的修復(fù)，維持和生長(zhǎng)有重要作用［22］。在廢用性肌萎縮發(fā)生時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量下降，再生能力不足［23］，神經(jīng)肌肉電刺激通過增強(qiáng)衛(wèi)星細(xì)胞的活化和增生，保持足夠的衛(wèi)星細(xì)胞池，促進(jìn)肌纖維再生從而緩解肌肉萎縮進(jìn)程［24］。試驗(yàn)證明，后肢懸吊28d 大鼠模型中，予比目魚肌20Hz，每天2 次，每次1h 的神經(jīng)肌肉電刺激可減少衛(wèi)星細(xì)胞的丟失，增加肌纖維的橫截面積［25］。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)新西蘭兔后肢固定建立腓腸肌廢用性肌萎縮模型，給予腓腸肌8Hz，每天1 次，每次1h，持續(xù)2 周的微電流電刺激，檢測(cè)到衛(wèi)星細(xì)胞有絲分裂活性增加，衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量增加，肌萎縮得到明顯緩解，表明電刺激可通過刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞增值分化來促進(jìn)萎縮肌肉再生［26］。

萎縮肌中的衛(wèi)星細(xì)胞需要不同的刺激方案，用于不同的細(xì)胞活動(dòng)，如激活，增殖和肌原性分化，刺激參數(shù)的優(yōu)化可能會(huì)強(qiáng)化干預(yù)的結(jié)果。后肢懸吊14d 大鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，予? Hz，每天2 次，每次1h 的神經(jīng)肌肉電刺激參數(shù)使衛(wèi)星細(xì)胞增殖增加2 倍，在阻止肌纖維橫截面積減少方面達(dá)到最佳效果［27］。

5 線粒體及氧自由基的變化

線粒體是參與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞分化與凋亡及信號(hào)傳遞的重要細(xì)胞器。廢用狀態(tài)下肌纖維內(nèi)線粒體體積及位置發(fā)生改變，使線粒體功能受損，產(chǎn)生大量活性氧造成細(xì)胞氧化性損傷，破壞正常的膜系統(tǒng)功能，進(jìn)一步使線粒體腫脹，同時(shí)溶酶體膜破壞［28］。損傷的線粒體氧化磷酸化水平出現(xiàn)障礙，能量產(chǎn)生不足，蛋白合成下降；膜破壞后的溶酶體釋放蛋白水解酶，使蛋白質(zhì)分解增加［29-30］。電刺激可能通過影響線粒體分裂和融合相關(guān)蛋白（Fis1、Drp1、Mfn1、Mfn2 、Opa1）的表達(dá)從而達(dá)到線粒體質(zhì)量控制和線粒體功能改善，進(jìn)而緩解肌肉蛋白的丟失［31］，但目前尚缺乏在廢用性肌萎縮中，電刺激對(duì)線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

除了上述機(jī)制外，也有學(xué)者從神經(jīng)肌肉電刺激通過調(diào)節(jié)微小RNA（microRNA）表達(dá)從而促進(jìn)肌肉蛋白表達(dá)展開研究。肌肉特異性microRNA（myomiRs）是一種含有22 個(gè)核酸的保守微小RNA，其中miR-1和miR-206 通過靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like Growth Factor 1，IGF1）的3'非編碼區(qū)從而阻止其翻譯，與肌肉蛋白的減少相關(guān)［32］。myomiRs 在肌生成中扮演的角色是多重的，其也直接靶向Pax3 和Pax7 啟動(dòng)肌生成程序［33］。目前已對(duì)幾種肌萎縮模型包括去神經(jīng)、禁食、糖尿病、癌癥惡病質(zhì)狀態(tài)下的小鼠肌肉的miR 進(jìn)行了分析，明確了在不同代謝情景下的miR 獨(dú)特表達(dá)模式［34］。如研究者給予慢性腎衰竭相關(guān)性肌萎縮患者20Hz 神經(jīng)肌肉電刺激，發(fā)現(xiàn)miR-1 和miR-206表達(dá)增加，肌細(xì)胞生成增多，表明慢性腎衰竭相關(guān)性肌萎縮中，神經(jīng)肌肉電刺激可以通過增加miR-1 和miR-206 促進(jìn)肌細(xì)胞蛋白生成［35］。在慢阻肺相關(guān)性低氧高二氧化碳導(dǎo)致的肌萎縮大鼠模型中，檢測(cè)到肌萎縮發(fā)生時(shí)，MiR486 明顯減少，但經(jīng)過神經(jīng)肌肉電刺激后，MiR486 表達(dá)增高［36］。但在廢用性肌萎縮模型中，對(duì)神經(jīng)肌肉電刺激后microRNA 表達(dá)情況尚未有相關(guān)研究，也是目前的研究方向之一。

6 小結(jié)

上述研究表明，神經(jīng)肌肉電刺激預(yù)防廢用性肌萎縮的療效是肯定的，在預(yù)防機(jī)制的研究中，肌肉蛋白合成相關(guān)通路Akt 途徑及MAPK 途徑的活化有重要作用；同時(shí)，神經(jīng)肌肉電刺激也可通過促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增值，抑制肌生成抑制蛋白的合成來緩解廢用性肌萎縮；線粒體質(zhì)量控制及功能改善、microRNA 相關(guān)通路改變也是可能機(jī)制之一，進(jìn)一步明確需要更深入研究；盡管泛素蛋白酶體及鈣蛋白酶是肌萎縮中肌肉蛋白降解的主要途徑，但神經(jīng)肌肉電刺激對(duì)泛素蛋白酶及鈣蛋白酶的作用情況尚有爭(zhēng)議。綜上可知，神經(jīng)肌肉電刺激預(yù)防廢用性肌萎縮的機(jī)制中，促進(jìn)肌蛋白合成的作用比抑制肌蛋白降解的作用更明顯，同時(shí)通過促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞再生分化也是電刺激預(yù)防廢用性肌萎縮的主要機(jī)制之一。