基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療的研究進展

戴 爽，覃虹錕，王鑫怡，宗 莉*，王亞菁*

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，南京 211198；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院生理學(xué)教研室，南京 211198；3.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，南京 211198)

黑色素瘤是一種惡性皮膚癌，其發(fā)病率占皮膚癌的5%，致死率卻高達皮膚癌相關(guān)死亡的75%[1]。早期黑色素瘤主要通過手術(shù)切除進行治療，但晚期和已轉(zhuǎn)移的黑色素瘤極難治療，死亡率極高，晚期黑色素瘤病人5年生存率低于20%[2]。轉(zhuǎn)移瘤的治療主要包括化學(xué)治療[3]、放射治療[4]、靶向治療[5]和免疫治療[6]。其中免疫治療近年來成為黑色素瘤治療的研究熱點之一，而與納米遞送系統(tǒng)聯(lián)用更是有望解決黑色素瘤免疫治療的現(xiàn)存問題。本文就基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療研究現(xiàn)狀進行簡要綜述。

1 黑色素瘤免疫治療現(xiàn)狀

黑色素瘤是最具有免疫原性的腫瘤之一，易于逃脫免疫監(jiān)控、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。免疫治療已被應(yīng)用于黑色素瘤的治療[7]，主要包括細胞因子治療[8]、免疫檢查點阻斷免疫治療[9]、過繼性免疫治療[10]和嵌合抗原受體T細胞免疫治療[11]等。

免疫檢查點抑制劑獲批之前，美國FDA批準采用化療(氮烯唑胺)、羥基脲或免疫治療(高劑量IL-2)作為晚期黑色素瘤的治療方案[1，12-13]。這些方案首次給藥有效率較高，能顯著提高總體生存率，但一般6～9個月后就會復(fù)發(fā)[14]。IL-2可延長緩解期，但其半衰期短，需要多次大劑量注射，具有嚴重的不良反應(yīng)[15]。2011年，美國FDA批準了首個免疫檢查點抑制劑ipilimumab(CTLA-4抑制劑)，用于治療晚期黑色素瘤，此后免疫檢查點抑制劑成為公認的晚期黑色素瘤免疫治療有效策略，顯著推進了晚期黑色素瘤免疫治療的發(fā)展。但免疫檢查點抑制劑僅對很小一部分病人有效，大部分病人對此類抑制劑沒有免疫響應(yīng)。

2 納米遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

納米遞送系統(tǒng)，即納米尺寸(1～100 nm)的藥物遞送系統(tǒng)，包括無機材料、有機材料和細胞仿生型等載體系統(tǒng)，具有降低給藥劑量、延長抗原呈現(xiàn)時間、增加穩(wěn)定性和誘導(dǎo)產(chǎn)生更強烈的T細胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點，有望用于晚期黑色素瘤的治療[16-18]。

2.1無機納米載體 無機納米載體主要是指無機材料(如金[19]、鐵[20]、石墨烯[21]和介孔硅[22]等)構(gòu)建的納米載體，具有粒徑小、尺寸可調(diào)、比表面積大、易修飾、穩(wěn)定性好和理化性質(zhì)特殊等優(yōu)點。

無機納米載體應(yīng)用于黑色素瘤免疫治療，可增強誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的增殖，促進效應(yīng)T細胞發(fā)揮作用。納米技術(shù)為免疫治療提供了新的遞送策略，但要實現(xiàn)高效激活T細胞仍待進一步完善。Steenblock E R等[23]報道，納米粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的短期免疫反應(yīng)遠不如微粒。Perica K等[24]基于生物相容性氧化鐵納米粒(50～100 nm)或生物素包裹的量子點納米晶(約30 nm)2種納米制劑，構(gòu)建了人造抗原呈遞細胞(APCs)納米遞送系統(tǒng)。體外實驗表明，構(gòu)建的2種載體都能誘導(dǎo)小鼠脾臟細胞和人外周血T細胞產(chǎn)生抗原特異性T細胞增殖。選用接種黑色素瘤細胞B16的裸鼠進行體內(nèi)實驗，能有效預(yù)刺激特異性細胞毒T淋巴細胞，減緩腫瘤生長，且效果優(yōu)于對照的人造APCs微米遞送系統(tǒng)。

此外，無機納米粒因其獨特的光、電、磁性質(zhì)，在顯影成像方面具有一定優(yōu)勢。常用的細胞追蹤方法是通過報告基因標記細胞，該標記方法持續(xù)時間較長，存在組織透光性差、無法定量等問題[25]。Meir R等[26]人工改造T細胞使其可以表達黑色素瘤特異性T細胞受體，并標記上葡萄糖修飾的金納米粒(約20 nm)作為計算機斷層掃描(CT)造影劑，將該T細胞靜脈注射進入移植了人黑色素瘤的小鼠體內(nèi)，可以追蹤檢測T細胞在體內(nèi)的分布、遷移和動力學(xué)。金納米粒不影響人工T細胞在小鼠體內(nèi)的分布和功能，且能穩(wěn)定標記在T細胞上，用于T細胞的CT追蹤。Chen F等[22]采用Cy5熒光二氧化硅納米粒，與黑皮素受體1(MC1-R)靶向的α黑色素細胞刺激素(αMSH)肽結(jié)合，用于黑色素瘤特異性顯影。MC1-R是靶向黑色素瘤特異性標志物的一種多肽，但由于腎攝取過多影響了其在臨床效果和治療中的應(yīng)用，該二氧化硅納米粒能有效解決這一問題。通過表面修飾優(yōu)化的αMSH肽，納米粒與MC1-R的親和力能提高10倍。體內(nèi)實驗表明，該二氧化硅納米粒在黑色素瘤小鼠模型中能有效靶向腫瘤，示蹤顯示其易通過受體介導(dǎo)的方式被腫瘤細胞內(nèi)吞。該納米遞送系統(tǒng)較好地克服了現(xiàn)有臨床黑色素瘤抗體類探針的耐藥和脫靶毒性等缺點，有望用于黑色素瘤特異性顯影和治療。

2.2有機納米載體 有機納米載體一般指以天然或合成有機高分子材料制備的納米粒。天然高分子材料包括殼聚糖[27]、海藻酸鈉[28]、透明質(zhì)酸[29]和當歸多糖[30]等，合成高分子材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)[31]、聚乙烯亞胺(PEI)[32]和聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子聚合物[33]等。有機高分子材料一般具有毒性低和生物可降解性等優(yōu)點。有機納米遞送系統(tǒng)既能通過載體修飾提高遞送效率和抗原呈遞效率，又能保護免疫疫苗不被降解，高效低毒地將藥物遞送至特定部位。

有機納米載體能夠降低劑量，減小毒性，尤其是對于半衰期較短、劑量較大的藥物。IL-2具有抗腫瘤活性，但重組IL-2蛋白在血清中半衰期短，需要重復(fù)大劑量注射才能起到效果，因而具有嚴重的不良反應(yīng)[34]。Yao H等[35]在低相對分子質(zhì)量聚乙烯亞胺(600 Da)上連接β環(huán)糊精，再修飾上葉酸，將制備得到的高分子材料和IL-2質(zhì)?；旌现苽涑杉s100 nm的復(fù)合物。癌旁注射該復(fù)合物能有效抑制腫瘤生長，延長B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6小鼠的生存期。此外，該復(fù)合物能刺激外周血中CD8+，CD4+ T細胞和自然殺傷細胞的激活和增殖，并增加其向腫瘤環(huán)境中的滲透。Park J等[36]采用脂質(zhì)聚合物凝膠遞送高劑量IL-2至免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中，結(jié)果表明，該納米制劑能有效提高生存率和自然殺傷細胞活性，延緩黑色素瘤生長。

有機納米載體能夠?qū)目乖f送給APCs，保護抗原肽等不被酶解，提高穩(wěn)定性。黑色素瘤免疫治療中常涉及抗原肽的遞送問題。有機高分子材料，如PLGA，形成的納米粒能有效保護抗原肽。有報道應(yīng)用PLGA納米粒用于遞送小鼠黑色素瘤抗原多肽重組人gp100(hgp100)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP2)。當注射進黑色素瘤小鼠后，與多肽和弗氏佐劑的混合制劑相比，這些載多肽的PLGA納米粒被樹突狀細胞(DCs)攝取更多，且誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細胞反應(yīng)更加強烈[17]。通過表面修飾DCs特異性或陽性的受體/生物標志物，可顯著提高納米粒遞送到DCs的效率，促進攝取和內(nèi)化，增強抗原呈遞給T淋巴細胞的能力[16，37]。

此外，載抗原納米粒有助于抗原被DCs攝取，避免疫苗制劑導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)(如鋁鹽，弗氏佐劑)。另外，鑒于可溶性蛋白或多肽是通過胞飲被APCs攝取，體內(nèi)極少呈現(xiàn)為膜上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)配體，聚合物納米粒包裹的抗原通過吞噬作用被內(nèi)化，能更有效的通過MHCⅠ類途徑被交叉呈遞給CD8+細胞[38]。因此，聚合物納米粒介導(dǎo)的抗原遞送系統(tǒng)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的T細胞免疫。

2.3細胞-納米仿生型載體 近期，細胞或細胞膜載體被用于藥物遞送，包括紅細胞[39]、巨噬細胞[40]、自然殺傷細胞[41]和干細胞[42]等。與外源性遞送系統(tǒng)相比，細胞載體屬于內(nèi)源性載體，免疫原性低，且具有長循環(huán)、自主靶向等優(yōu)點，在黑色素瘤免疫治療中有一定的優(yōu)勢[43]。

免疫細胞等循環(huán)細胞近年來成為新型遞送載體，具有長循環(huán)等特點，有些免疫細胞還具有腫瘤趨向性。Xie Z等[44]選用人外周血的單核細胞(THP-1)，攝取包裹維羅非尼(Vemurafenib)的聚合物納米粒進入胞內(nèi)，形成單核/巨噬細胞遞送系統(tǒng)，以靶向治療黑色素瘤。THP-1作為單核細胞模型，與腫瘤細胞和炎癥細胞之間的親和力高。利用THP-1作為免疫細胞靶向腫瘤細胞的能力，內(nèi)吞可降解納米粒，通過細胞內(nèi)載藥，實現(xiàn)腫瘤特異性藥物遞送。體外實驗結(jié)果表明，基于THP-1的納米粒遞送系統(tǒng)能有效發(fā)揮維羅非尼對1205Lu和WM35 2種黑色素瘤細胞的殺傷作用。這種遞送系統(tǒng)不僅有望用于其他免疫治療藥物的遞送，也有望用于其他涉及固有免疫反應(yīng)的疾病。

抗原呈遞給APCs是啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟，一些天然的微生物處于微米級尺寸，易被APCs識別，發(fā)揮疫苗佐劑的作用，如釀酒酵母S.cerevisiae可靶向遞送抗原至APCs，且無病原性，能起到免疫佐劑的作用[45]。Liu D Q等[46]采用重組釀酒酵母作為疫苗載體，該重組釀酒酵母的細胞壁上能表達黑色素瘤相關(guān)抗原Trp2，并通過靜電作用在酵母細胞壁上修飾包裹了吲哚2,3-雙加氧酶(IDO)siRNA的PEI納米粒，以克服免疫抑制。該細胞遞送系統(tǒng)遞送的特異性siRNA能被APCs有效攝取，產(chǎn)生強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)和siRNA的用量和毒性。體內(nèi)外實驗表明，該酵母細胞遞送載體能有效抑制DCs中的IDO表達，促進抗Trp2的T細胞免疫反應(yīng)，降低了調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。此外，重組酒釀酵母遞送系統(tǒng)通過削弱免疫抑制，促進Trp2特異性CD8+ T細胞免疫應(yīng)答，顯著抑制了小鼠黑色素瘤生長。

除了一些細胞載體外，也有一些是只基于細胞膜設(shè)計的遞送系統(tǒng)，具有生物組成、抗原成分和理化性質(zhì)方面的優(yōu)點。Guo Y等[47]采用紅細胞膜包裹PLGA納米粒，構(gòu)建了一種新型抗原肽遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)兼具PLGA納米粒的載藥功能和紅細胞膜的固有性質(zhì)。紅細胞可用于將抗原靶向遞送給DCs，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)。作為抗原載體，紅細胞膜可以保護抗原不被血液清除，遞送抗原，APCs處理后直接將抗原遞送給免疫細胞[48]。將DSPE-PEG-甘露糖組裝到紅細胞膜上，構(gòu)建了DSPE-PEG-甘露糖-紅細胞膜載體，再將載有hgp的 PLGA納米粒(雙硫鍵連接hgp和PLGA)包裹其中，形成的遞送系統(tǒng)能夠有效靶向淋巴組織中的APCs，體內(nèi)外實驗表明，對黑色素瘤均具有較好的療效。

3 小結(jié)

作為最難治療的腫瘤之一，晚期黑色素瘤一直處于腫瘤免疫治療的前沿[49]。除了免疫檢查點抑制劑外，一些其他新型免疫治療方式也正在探索發(fā)展中[50]，包括溶瘤病毒療法[51]和治療疫苗[52]等。但目前的黑色素瘤免疫治療存在不良反應(yīng)、響應(yīng)低和復(fù)發(fā)高等問題[18，53-54]。

納米遞送系統(tǒng)有望解決黑色素瘤免疫治療現(xiàn)存的問題。無機納米遞送系統(tǒng)，不僅能增強治療效果，還能實現(xiàn)成像和追蹤。有機納米遞送系統(tǒng)，既能保護免疫多肽和核酸不被降解，又能實現(xiàn)藥物的緩釋控釋。細胞-納米仿生型遞送系統(tǒng)不僅能避免外源性遞送系統(tǒng)的高免疫原性，還能自主靶向，提高遞送效率，增強療效。

雖然將納米遞送系統(tǒng)應(yīng)用于黑色素瘤免疫治療的研究取得了許多進展，但仍存在一些問題有待解決。如納米遞送系統(tǒng)所依賴的EPR效應(yīng)存在一定的局限性，無法應(yīng)用于腫瘤內(nèi)低灌注和缺氧的部分[55]。納米遞送系統(tǒng)進入機體后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，限制了其在黑色素瘤免疫治療中的實際應(yīng)用[56]，這些需要進一步的研究改善。

近年來基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療有了許多進展，但還存在納米遞送的實際靶向效果遠低于理論設(shè)計、機體免疫應(yīng)答的個體差異大和晚期黑色素瘤生存期短等問題。基于納米遞送系統(tǒng)的黑色素瘤免疫治療有待進一步研究和完善，以應(yīng)用于臨床。