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    外部環(huán)境條件對香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    2020-12-07 10:03:36牟超
    新農(nóng)業(yè) 2020年11期
    關(guān)鍵詞:外部環(huán)境

    牟超

    摘要:以香菇菌株0912試材,以原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率為指標(biāo),探究酶種類、酶解時間、酶解溫度、pH、穩(wěn)滲劑種類、穩(wěn)滲劑濃度及菌絲菌齡等7個因素對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響。通過單因素試驗,發(fā)現(xiàn)幾種因素在固定限度之中時,都能夠提升原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率,并且具有明顯的效果。原生質(zhì)體的最佳制備條件為,在pH為5.0的條件下,使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑,在溫度達(dá)到28℃時,對5日齡菌絲進(jìn)行酶解3小時。最佳再生條件為,在pH為5.5的條件下,使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑,在溫度達(dá)到27.8℃時對6.5日齡菌絲進(jìn)行酶解2.9小時。

    關(guān)鍵詞:香菇菌種;外部環(huán)境;原生質(zhì)體產(chǎn)量;原生質(zhì)體再生率

    香菇富含多種營養(yǎng)(包括維生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)元素),同時具有宜人的香氣,食之味道鮮嫩,口感絕佳,食用價值較高。香菇又被稱為冬菇或香蕈,在分類學(xué)中屬于擔(dān)子菌綱,傘菌目,口蘑科,香菇屬,是一種為人們所喜愛的常見食用菌。

    中國是香菇消費和生產(chǎn)的大國,并且中國的香菇栽培規(guī)模也位列于世界的前端,然而在香菇的育種研究方面卻有些許落后。所以,當(dāng)務(wù)之急是香菇新品種研發(fā)以及原有品種的改良工作。目前較為常用的育種手段是原生質(zhì)體技術(shù),這一技術(shù)能夠在一定程度上有效縮短食用菌的育種周期,但是,此項技術(shù)還未在全國范圍內(nèi)進(jìn)行推廣實施,目前由原生質(zhì)體技術(shù)所派生出的育種技術(shù)主要有以下4類,原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體單核化。相對于其他育種方式而言,原生質(zhì)體育種具有育種周期短、效率高的特點,同時對于食用菌的品質(zhì)、產(chǎn)量以及抗性都有顯著的提升效果,進(jìn)而提高香菇的育種水平。這個過程里面原生質(zhì)體育種的基礎(chǔ)是原生質(zhì)體的制備和再生。所以,本文重點研究外部環(huán)境條件對于香菇原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響,以此作為食用菌類的原生質(zhì)體育種工作的參照。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試食用菌種:香菇(Letinula Edodes)遼撫4號編號0912,由撫順市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供;母種培養(yǎng)基(克/升):馬鈴薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0(煎汁過濾)、硫酸鎂0.5、磷酸二氫鉀1.0、水1000.0、瓊脂粉12.0,培養(yǎng)基的酸堿度調(diào)整至5.5;再生培養(yǎng)基:與母種相同,外加穩(wěn)滲劑進(jìn)行定容。

    穩(wěn)滲劑配置:甘露醇、0.4摩爾/升的硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀,pH=5的蔗糖和葡萄糖液體。其他試驗試劑:0.22微米微孔濾膜過濾除菌,該試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用,酶液用對應(yīng)穩(wěn)滲劑配制酶濃度(W/V,重量體積比)1.0%的蝸牛酶,纖維素酶與混合酶(蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1)。Cellulase(MP Biomedical)及Snailase(Wolsen)等為國產(chǎn)分析純。

    1.2 試驗方法

    原生質(zhì)體數(shù)量統(tǒng)計:利用血球板進(jìn)行計數(shù),首先將原生質(zhì)體稀釋至108,涂至平板上,然后按照公式:原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/毫升)=每格平均原生質(zhì)體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104進(jìn)行計算。

    原生質(zhì)體再生率(%)=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù))×稀釋倍數(shù)]/(涂布體積×原生質(zhì)體濃度)×100

    方案設(shè)計:選取7個外部環(huán)境因素,考察這7個外部環(huán)境因素對香菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率的具體影響。詳情見表1。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1 不同種類裂解酶原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    如圖1所示,混合酶的酶解效果要比單一酶所產(chǎn)生的酶解效果好一些,混合酶作為酶解介質(zhì)時,單位時間內(nèi)原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高能達(dá)5.69×108個/毫升,此產(chǎn)量是蝸牛酶作為酶解介質(zhì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的1.42倍,是纖維素酶作為酶解介質(zhì)產(chǎn)量的4.15倍;混合酶作為酶解介質(zhì)時,原生質(zhì)體再生率是0.91%,蝸牛酶作為酶解介質(zhì)的原生質(zhì)體再生率為0.9%,達(dá)到了纖維素酶作為酶解介質(zhì)時原生質(zhì)體再生率的2.39倍。產(chǎn)生如此大差異的原因是,香菇自身的菌絲細(xì)胞壁組成成分比較復(fù)雜,因此,需要不同種類的酶共同作用,才能對其產(chǎn)生較好的降解作用。在此組試驗中,蝸牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多種不同種類的酶于一體。因此,其酶解效果與混合酶一樣能夠較好的刺激原生質(zhì)體的再生,但是纖維素酶成分比較單一,故而對原生質(zhì)體的酶解效果一般。綜上研究,在后續(xù)的多因素試驗中會優(yōu)先選擇混合酶作為介質(zhì)。

    2.2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    通過圖2可以看出,酶解時間在3小時之內(nèi)時,原生質(zhì)體再生率與時間呈正相關(guān)的關(guān)系,隨著時間的增加,原生質(zhì)體的產(chǎn)量也不斷增加。之后,原生質(zhì)體的再生率則會出現(xiàn)下降。在整個酶解過程中原生質(zhì)體產(chǎn)量從2小時后明顯上升,2.5小時后逐漸下降?;貧w分析后,可知酶解時間為2.82小時,原生質(zhì)體再生率達(dá)到頂點1.7%;酶解時間為3.44小時,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高2.27×108個/毫升。

    2.3 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生率受溫度影響效果明顯,其中30℃是原生質(zhì)體產(chǎn)量變化的臨界點,在這之前原生質(zhì)體產(chǎn)量醉著溫度升高而增加,之后則出現(xiàn)明顯的下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出,原生質(zhì)體再生率在30℃達(dá)到最高,為1.08%,原生質(zhì)體產(chǎn)量在29℃達(dá)到最高,為4.06×108個/毫升。分析其他酶解介質(zhì)可以得出,蝸牛酶的最適酶解溫度范圍是30~37℃,纖維酶的最適酶解溫度為35℃左右,當(dāng)溫度處于最適酶解溫度時,其對于菌絲體細(xì)胞壁的酶解效果最好。因此,菌絲的細(xì)胞壁分解效率較高。而對于混合酶來說,雖然在35℃時酶活性較高,但是較高的溫度會擾亂菌絲的內(nèi)部代謝,影響細(xì)胞體內(nèi)部穩(wěn)定性,最終影響原生質(zhì)體的產(chǎn)生。因此,當(dāng)溫度高于30℃,原生質(zhì)體的再生率和產(chǎn)量均出現(xiàn)了明顯下降。

    2.4 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    試驗結(jié)果如圖3,當(dāng)菌齡低于4天,隨著菌齡的增加,原生質(zhì)體的產(chǎn)量也會增加,當(dāng)菌齡高于4天時,隨著菌齡的增加,原生質(zhì)體的再生率逐步降低;當(dāng)菌齡大于6天時,原生質(zhì)體再生率急速下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出:原生質(zhì)體再生率在5.4天時達(dá)到最高,約為2.07%;原生質(zhì)體的產(chǎn)量在4.1天時達(dá)到頂點,為2.01×108個/毫升。

    2.5 穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體制備產(chǎn)量與再生率的影響

    圖4可以看出,當(dāng)選取甘露醇作為滲穩(wěn)劑時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高但是再生率很低,當(dāng)使用硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量排名第三,僅處于甘露醇和葡萄糖作為滲穩(wěn)劑之后;硫酸鎂的再生率為1.73%,葡萄糖的再生率為1.60%,此再生率僅次于用蔗糖當(dāng)作穩(wěn)滲劑的再生平板,蔗糖的再生率為1.94%。由于在制備原生質(zhì)體時,使用硫酸鎂當(dāng)作穩(wěn)滲劑,不但能夠較好的維持菌絲體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的穩(wěn)定性,同時滲穩(wěn)劑中的Mg2+也能夠通過交聯(lián)羧基和磷脂質(zhì)實現(xiàn)維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用。但是Mg2+的供能能力較差,難以維持細(xì)胞壁再生所需要的能量,同理單糖也無法實現(xiàn)此項需求。因此,想要實現(xiàn)原生質(zhì)體再生率最大化,應(yīng)該選用硫酸鎂作為制備滲穩(wěn)劑,蔗糖作為再生滲穩(wěn)劑。

    2.6 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    圖5可以看出,滲穩(wěn)劑濃度對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都能產(chǎn)生影響,當(dāng)使用純凈水作為參照時,目標(biāo)菌絲的原生質(zhì)體產(chǎn)量是4.2×107個/毫升,原生質(zhì)體的再生率為0。在此基礎(chǔ)上不斷加大滲穩(wěn)劑的濃度,可以看出原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率均呈現(xiàn)先增大后減小的變化。通過觀察試驗曲線可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度低于0.2摩爾/升時,隨著濃度增加,原生質(zhì)體再生率提升明顯,此后隨著濃度增加原生質(zhì)體再生率無明顯變化;經(jīng)過回歸方程計算:當(dāng)滲穩(wěn)劑濃度為0.51摩爾/升時,原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高1.85×108個/毫升,當(dāng)穩(wěn)滲劑的濃度為0.33摩爾/升的時候,原生質(zhì)體的再生率會達(dá)到最大值為1.97%。

    2.7? pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量與再生率的影響

    通過觀察下圖6,可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)滲穩(wěn)劑pH處于3~4時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量基本上是穩(wěn)定沒有變化,原生質(zhì)體的再生率為0;當(dāng)處于4~5時,對于原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都有顯著的提升刺激;當(dāng)處于5~7時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量與再生率都會出現(xiàn)不同程度的下降,回歸分析后得出,當(dāng)pH為5.10時,原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到最大值,為2.34×108個/毫升,當(dāng)pH為5.69時,原生質(zhì)體的再生率可達(dá)到最大值,為1.86%。

    3? 小結(jié)與討論

    供給試驗使用的幾種因素在固定限度之中時,都能夠提升原生質(zhì)體的產(chǎn)量以及再生率,并且具有明顯的效果。原生質(zhì)體的最佳制備條件為,在pH為5.0的條件下,使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑,在溫度達(dá)到28℃的時候?qū)?日齡菌絲進(jìn)行酶解3小時。最佳再生條件為,在pH為5.5的條件下,使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑,在溫度達(dá)到27.8℃的時候?qū)?.5日齡菌絲進(jìn)行酶解2.9小時。

    酶活和酶解的反應(yīng)時間將會決定原生質(zhì)體的產(chǎn)量大小,各種因素對原生質(zhì)體的產(chǎn)量所造成的影響效果由小到大依次為,滲穩(wěn)劑、菌齡、酶解時間、酶解溫度。同時,酶活性受到酶解液pH和酶解溫度的影響,進(jìn)而影響原生質(zhì)體產(chǎn)量。當(dāng)pH為4.5~6.0范圍內(nèi),則45~55℃為纖維素酶的最適宜溫度,30~37℃為蝸牛酶的最適宜溫度,酶促反應(yīng)的快慢與酶活性成正相關(guān)關(guān)系;同時混合酶的酶解效果要比單一酶效果顯著;在單位時間內(nèi),混合酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量要大于單一酶所產(chǎn)生的原生質(zhì)體的數(shù)量。

    原生質(zhì)體活性的大小可直接決定原生質(zhì)體再生率的大小,本次研究中選取的各項因素對于原生質(zhì)體再生率影響效果由小到大分別是,酶解溫度、菌齡、酶解時間、滲穩(wěn)劑濃度。滲穩(wěn)劑的濃度過大會導(dǎo)致原生質(zhì)體失水失活、滲穩(wěn)劑濃度過小會導(dǎo)致原生質(zhì)體脹破,這都會影響原生質(zhì)體的再生率。當(dāng)反應(yīng)酶處于其適宜反應(yīng)條件時,酶解的反應(yīng)比較快速,因為混合酶系能夠?qū)Ω鞣N各樣的底物進(jìn)行酶解反應(yīng),但是,隨著酶解時間不斷增加,原生質(zhì)體膜暴露時間過長會導(dǎo)致其細(xì)胞壁再生率下降。因此,原生再生率也將會減弱。溫度為(25±1)℃時,是香菇菌絲和原生質(zhì)體的最佳生長溫度,過高或者過低均會影響再生率。

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