DLL3表達(dá)與晚期小細(xì)胞肺癌含鉑化療療效及預(yù)后的相關(guān)性

韓淑華，黃見(jiàn)玲，曹丹丹，苑仁祥，劉丹丹，齊保龍

0 引言

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）起源于支氣管神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，是肺癌中較為特殊的一種類型，占全球每年新發(fā)肺癌病例的15%～20%[1-2]。SCLC生長(zhǎng)迅速，增殖率高，易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度在所有類型肺癌中最高。目前SCLC常用的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)有AJCC/UICC的TNM分期及美國(guó)退伍軍人醫(yī)院的局限期（1imited disease,LD）/廣泛期（extensive disease,ED）兩種方法，LD對(duì)應(yīng)TNM分期中的Ⅰ～Ⅲ期，ED對(duì)應(yīng)Ⅳ期。對(duì)于晚期SCLC（Ⅲ期+Ⅳ期）患者，化療是主要的治療手段，標(biāo)準(zhǔn)的初始治療為順鉑或卡鉑聯(lián)合依托泊苷[3-4]，雖然早期能夠取得一定療效，但容易產(chǎn)生耐藥及復(fù)發(fā)，整體預(yù)后較差，目前仍缺乏評(píng)估化療療效及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

DLL3是Notch信號(hào)通路的配體之一，在正常肺組織和肺鱗癌中無(wú)表達(dá)，但在80%以上的SCLC細(xì)胞表面可檢測(cè)到DLL3的表達(dá)，更重要的是DLL3在腫瘤起始細(xì)胞和耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[5-7]，提示DLL3可能與SCLC復(fù)發(fā)及耐藥相關(guān)，但目前關(guān)于DLL3在SCLC中的表達(dá)與化療療效及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，本研究回顧性分析DLL3在晚期SCLC組織中的表達(dá)與晚期或轉(zhuǎn)移性SCLC一線含鉑化療療效的關(guān)系及其預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年2月—2017年12月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院首次診斷為Ⅲ/Ⅳ期SCLC并治療的64例患者，所有患者診斷均經(jīng)纖維支氣管鏡或肺穿刺活檢獲得病理確診。末次隨訪時(shí)間是2018年6月30日。其中男55例，女9例；中位年齡為66歲（44～89）歲，ECOG評(píng)分0～1分；78.1%（50/64）患者為吸煙者；按2017國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control,UICC）肺癌TNM分期分為：Ⅲ期23例，Ⅳ期41例。64例患者均完成2周期以上EP方案化療（順鉑：25 mg/(m2·d)×3和依托泊苷：100 mg/(m2·d)×3，每21天為一周期）；納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）肺部有可測(cè)量的病灶；（3）ECOG評(píng)分0～1；（4）預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥2月；（5）具有足夠石蠟包埋組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝腎功能障礙和血液系統(tǒng)疾病；（2）合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤或肺轉(zhuǎn)移性腫瘤。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（2018ZDSYLL089），組織標(biāo)本收集及應(yīng)用經(jīng)得患者及其家屬知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)DLL3在晚期SCLC組織中的表達(dá)

兔抗DLL3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，羊抗兔二抗、即用型SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司，DAB顯色液、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、蘇木精染液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要步驟：切取3 μm厚石蠟包埋組織，切片脫蠟水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)20 min，3%H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS緩沖液沖洗，DLL3多克隆抗體按1:100稀釋后4℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育15 min，SABC 37℃孵育15 min，DAB染色，蘇木精對(duì)比染色，酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。采用免疫組織化學(xué)染色結(jié)果半定量分析計(jì)數(shù)系統(tǒng)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率（percentage of positive cells,PPC）和染色強(qiáng)度（staining intensity,SI）綜合計(jì)分進(jìn)行結(jié)果判定。其中染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分、弱染色為1分、中等染色為2分、強(qiáng)染色為3分，陽(yáng)性細(xì)胞的百分率：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分、＜10%陽(yáng)性細(xì)胞為1分、10%～50%陽(yáng)性細(xì)胞為2分、≥50%～80%陽(yáng)性細(xì)胞為3分、≥80%陽(yáng)性細(xì)胞為4分，以兩者乘積免疫組織化學(xué)總分（immuno-reactive sum score,IRS）進(jìn)行分組，即IRS=SI×PPC，IRS≥6分為高表達(dá)組（DLL3-high），＜6分為低表達(dá)組（DLL3-low）。

1.3 療效評(píng)估

按照實(shí)體腫瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1（RECIST 1.1），每2周期化療后進(jìn)行療效評(píng)估。包括完全緩解（complete response,CR）、部分緩解(partial response,PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease,PD），CR或PR的患者4周后再確認(rèn)療效。有效率（response rate,RR）=（CR+PR）/總病例數(shù)×100%。疾病控制率（disease control rate,DCR）=（CR+PR+SD）/總病例數(shù)×100%。預(yù)后分析指標(biāo)：無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）定義為從首次診斷至疾病進(jìn)展或最后一次隨訪的時(shí)間?？偵嫫冢╫verall survival,OS）定義為從首次診斷到死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。DLL3表達(dá)與臨床特征、化療療效的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Kaplan-Meier方法進(jìn)行單因素生存分析，Log rank檢驗(yàn)差異性，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLL3表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

全組64 例晚期SCLC患者中，有54 例（84.1%）患者DLL3表達(dá)陽(yáng)性，其中DLL3低表達(dá)（0＜IRS＜6）34例（54.7%）；DLL3高表達(dá)（IRS≥6）20例（29.7%），10例無(wú)陽(yáng)性表達(dá)（IRS=0）。陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，見(jiàn)圖1。根據(jù)1.2分組標(biāo)準(zhǔn)，最終10例無(wú)表達(dá)患者與34例IRS＜6分的低表達(dá)患者被分至DLL3-low組（n=44），20例IRS≥6分的患者被分至DLL3-high組（n=20）。DLL3表達(dá)與患者性別、年齡、分期、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 DLL3在晚期SCLC組織中的表達(dá) (×200)Figure 1 DLL3 expression in advanced SCLC tissues (×200)

表1 DLL3在晚期SCLC中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 (n)Table 1 Relation between DLL3 expression and clinical parameters of advanced SCLC patients (n)

2.2 DLL3表達(dá)與化療反應(yīng)率及預(yù)后的關(guān)系

對(duì)患者化療療效分析顯示，DLL3高表達(dá)組CR 0例，PR 6例（30.0%），SD 4例（20.0%）和PD 10例（50.0%），RR為30.0%，DCR為50.0%。DLL3低表達(dá)組中，CR 1例（2.3%），PR 29例（65.9%），SD 7例（15.9%）和PD 7例（15.9%），RR為68.2%，DCR為84.1%。DLL3低表達(dá)組化療有效率及疾病控制率均高于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.145,P=0.006;χ2=8.192,P=0.007）。DLL3高表達(dá)組患者的PFS為4.9月，DLL3低表達(dá)組為7.0月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025），見(jiàn)圖2A；DLL3高表達(dá)患者中位OS為13.0月，DLL3低表達(dá)患者中位OS為16.6月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.071），見(jiàn)圖2B。單因素生存分析結(jié)果顯示，DLL3表達(dá)、腫瘤分期及腫瘤直徑是影響PFS的重要因素，腫瘤分期是影響OS的重要因素，見(jiàn)表2、3。Cox多因素分析結(jié)果顯示，DLL3低表達(dá)、腫瘤分期早、腫瘤直徑＜5 cm是晚期SCLC患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素，腫瘤分期是OS的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖2 DLL3的表達(dá)與晚期SCLC患者無(wú)進(jìn)展生存期(A)及總生存期(B)的關(guān)系Figure 2 Relation between DLL3 expression and PFS(A),OS(B) of advanced SCLC patients

表2 單因素分析晚期SCLC患者臨床特征與無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期的關(guān)系Table 2 Univariate analysis of relation between clinical characteristics and PFS,OS of patients with advanced SCLC

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，全球發(fā)病率居惡性腫瘤的首位，每年肺癌相關(guān)死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[2]。其中小細(xì)胞肺癌惡性程度在所有類型肺癌中最高[1]，多數(shù)患者在初診時(shí)即有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，一般不適合手術(shù)治療，SCLC對(duì)化療及放療敏感，但很快會(huì)出現(xiàn)耐藥而導(dǎo)致病情進(jìn)展。SCLC一線治療主要依賴于含鉑化療，例如卡鉑/順鉑聯(lián)合依托泊苷或伊立替康[1]。雖然SCLC對(duì)一線治療的反應(yīng)率很高（50%～70%），但仍有部分患者化療療效差，鑒于化療存在骨髓抑制、肝腎功能損傷等可影響患者生活質(zhì)量的不良反應(yīng)，因此尋找可能預(yù)測(cè)化療療效的相關(guān)標(biāo)志物有助于幫助臨床醫(yī)生評(píng)估化療的必要性，為患者制定個(gè)體化治療方案。

表3 Cox回歸多因素分析晚期SCLC患者臨床特征與無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期的關(guān)系Table 3 Multivariate Cox prognosis analysis of relation between clinical characteristics and PFS,OS of patients with advanced SCLC

DLL3作為Notch信號(hào)通路的抑制性配體，已在部分腫瘤中證實(shí)具有促進(jìn)腫瘤增殖的作用。過(guò)表達(dá)DLL3能夠促進(jìn)人胃癌及肺腺癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[7-8]。下調(diào)DLL3表達(dá)后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制[9]。SCLC中DLL3可能在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用[10-11]。多項(xiàng)研究證實(shí)DLL3在SCLC腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常肺組織中不表達(dá)[6-7,12]。在本試驗(yàn)中，我們采用免疫組織化學(xué)的方式檢測(cè)了DLL3在晚期SCLC組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在84.1%的晚期SCLC腫瘤組織中可檢測(cè)到DLL3的表達(dá)，定位于細(xì)胞膜，且表達(dá)水平與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、腫瘤大小均無(wú)相關(guān)性，與以往文獻(xiàn)結(jié)果一致[6]。結(jié)果表明DLL3表達(dá)情況可能影響SCLC對(duì)EP方案化療的敏感度。另外DLL3在晚期SCLC腫瘤組織中的表達(dá)水平與患者的PFS相關(guān)，DLL3高表達(dá)組患者的PFS較低表達(dá)組縮短。這也間接證實(shí)DLL3能夠影響SCLC患者對(duì)化療的敏感度，可能的機(jī)制是DLL3參與化療耐藥的形成。首先DLL3在SCLC腫瘤起始細(xì)胞（tumor initiating cells,TICs）中表達(dá)，而TICs與腫瘤耐藥能力具有密切關(guān)系[13]。Saunders等[5]進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以鑒定活檢或手術(shù)切除SCLC和LCNEC腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有患者TICs中可檢測(cè)到DLL3基因的表達(dá)，而抗DLL3靶向抗體-藥物偶聯(lián)物Rovalpituzumab teserine（Rova-T; SC16LD6.5）能夠根除SCLC和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中的TICs[5]，提示DLL3可能在維持TICs生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。其次，DLL3調(diào)控上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）進(jìn)程[14]，EMT與腫瘤化療耐藥關(guān)系密切，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可獲得凋亡抵抗，逃逸順鉑的細(xì)胞毒作用，產(chǎn)生對(duì)順鉑耐藥[15-17]。再者，DLL3能夠激活P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]，這是目前證實(shí)與腫瘤細(xì)胞化療抵抗相關(guān)的一條通路[19]。但目前尚無(wú)關(guān)于DLL3與化療耐藥直接關(guān)系的報(bào)道，需要更多的研究來(lái)驗(yàn)證兩者的關(guān)系。對(duì)于DLL3與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道在NSCLC、小細(xì)胞膀胱癌及子宮內(nèi)膜癌中，DLL3高表達(dá)患者相對(duì)于低表達(dá)者預(yù)后差，即DLL3高表達(dá)提示不良預(yù)后[20-21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLL3影響晚期SCLC患者的PFS，但對(duì)OS無(wú)顯著影響，可能的原因是：（1）我們檢測(cè)DLL3表達(dá)時(shí)采用的是免疫組織化學(xué)的方法，此方法為半定量分析方法，且受實(shí)驗(yàn)者技術(shù)水平的影響，結(jié)果判斷方面也具有一定的主觀性。（2）SCLC患者的預(yù)后受多種因素的影響，且存在個(gè)體差異性，部分患者可能為非腫瘤性死亡，影響了最終結(jié)果的判斷。（3）本研究為回顧性研究，隨訪過(guò)程中部分患者失訪，部分患者截至隨訪日期時(shí)仍存活，總體失訪率達(dá)到10.9%。因此，需要更多的前瞻性、多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果。另外單一標(biāo)志物用于療效及預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的局限性，而在某些研究中提到甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）單一指標(biāo)不能用來(lái)預(yù)測(cè)SCLC預(yù)后，但DLL3與TTF-1聯(lián)合卻是SCLC的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（P=0.001），能很好預(yù)測(cè)SCLC的預(yù)后[22-23]，后期可研究多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合的預(yù)測(cè)價(jià)值。有研究報(bào)道，血清胃泌素釋放肽前體（ProGRP）在對(duì)于SCLC具有較高的療效評(píng)價(jià)價(jià)值，而神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）能夠較好的判斷預(yù)后[24-25]，未來(lái)可將這些標(biāo)志物聯(lián)合DLL3應(yīng)用于療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估，做到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為臨床醫(yī)生制定個(gè)體化治療方案及更好評(píng)估病情提供幫助。

綜上，DLL3表達(dá)與晚期SCLC患者化療反應(yīng)率和PFS呈負(fù)相關(guān)，DLL3可能是預(yù)測(cè)SCLC化療敏感度及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，進(jìn)一步研究其與化療耐藥的相關(guān)性可能為SCLC的治療提供新的思路。DLL3高表達(dá)與低表達(dá)患者OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DLL3表達(dá)對(duì)于晚期SCLC患者的長(zhǎng)遠(yuǎn)預(yù)后無(wú)預(yù)測(cè)價(jià)值。