乙肝耐藥全基因測(cè)序分析研究

姜靜，萬(wàn)浩，李徐圖，謝文英，蔣麗琳，楊瑞生，張平，孟冬梅

（武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司 營(yíng)銷(xiāo)感染市場(chǎng)部，湖北省 武漢市 430000）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個(gè)全球性健康問(wèn)題，它增加了患者肝硬化、肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，需要終生治療。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年約有88.7萬(wàn)人死于HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化或原發(fā)性肝癌。全世界約有2.57 億人患有慢性乙型肝炎，其中非洲和亞洲的感染率最高［1］。在我國(guó)60%肝硬化和80%肝細(xì)胞癌患者由HBV 感染引起［2］。核苷（酸）類(lèi)抗病毒藥物是目前治療慢性乙型肝炎的主流，但核苷類(lèi)似物的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致患者體內(nèi)不同程度出現(xiàn)病毒耐藥突變。耐藥變異是HBV 經(jīng)過(guò)抗病毒藥物的選擇，逐漸對(duì)治療藥物失去敏感性，從而產(chǎn)生抗藥性的過(guò)程。HBV 耐藥性的出現(xiàn)是悄無(wú)聲息的，難以無(wú)法在第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)。只有當(dāng)耐藥的HBV 繁殖到一定數(shù)量，才能通過(guò)現(xiàn)有的HBV-DNA 檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)［3］。HBV 在核苷（酸）類(lèi)抗病毒藥物的作用下會(huì)發(fā)生一個(gè)或多個(gè)耐藥位點(diǎn)的突變。如何及時(shí)靈敏地預(yù)測(cè)耐藥株的出現(xiàn)，為臨床醫(yī)生提供選擇最佳替換治療方案或重新選擇治療時(shí)機(jī)顯得尤為必要。分析HBV 耐藥突變位點(diǎn)對(duì)于臨床抗病毒治療方案的選擇以及流行病學(xué)的研究意義重大。筆者采用全基因測(cè)序方法，隨機(jī)選取分析了2019 年1 月至2019 年5 月126 例患者的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果，為評(píng)價(jià)藥物治療效果和合理用藥提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本組126 例，男89 例，女37 例；年齡12～75 歲。所有患者均為接受核苷（酸）類(lèi)藥物抗病毒治療的慢乙肝患者。核苷（酸）類(lèi)藥物包括拉米夫定（LAM），阿德福韋（ADV），恩替卡韋（ETV），替比夫定（LdT）和替諾福韋酯（TDF）

1.2 主要儀器和試劑

巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）所用儀器為BIO-RAD 基因擴(kuò)增儀，測(cè)序所用儀器為ABI 3700。采集患者血清，按試劑盒要求的步驟從血清中提取HBV DNA，所用試劑盒購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司。進(jìn)行巢式PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后，產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)其耐藥位點(diǎn)形式。所用試劑盒為BigDye Direct Sanger Sequencing Kit。

1.3 HBV 耐藥位點(diǎn)分析

為確定所研究病毒群體中是否存在與所用藥物有關(guān)的耐藥突變位點(diǎn)，共分析25 個(gè)可能出現(xiàn)的耐藥突變位點(diǎn)。與HBV 標(biāo)準(zhǔn)序列片段進(jìn)行比對(duì)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行位點(diǎn)突變分析。見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 耐藥位點(diǎn)突變率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

126 例患者中，74 例（58.7%）檢測(cè)到耐藥位點(diǎn)突變，主要發(fā)生在204 位點(diǎn)和180 位點(diǎn)，突變率占比分別為44%和33%。其次為181 位點(diǎn)，突變率占13%。主要是與LAM 耐藥相關(guān)的位置。其他位點(diǎn)具體如圖1 所示。其中L180M+M204V+A181G/C 的突變，已有報(bào)道［4］稱(chēng)可能對(duì)ETV 耐藥，可以更好指導(dǎo)用藥。

表1 檢測(cè)位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)核苷酸和氨基酸

圖1 耐藥位點(diǎn)突變率

2.2 耐藥突變位點(diǎn)連鎖分析結(jié)果

在檢測(cè)到的發(fā)生耐藥突變的74 例患者中，發(fā)生耐藥位點(diǎn)連鎖突變的49 例，占66.2%。突變位點(diǎn)的連鎖模式達(dá)36 種，最主要的連鎖突變位點(diǎn)是M204V+L180M+S202G，占24.5%（12 例）。男性發(fā)生耐藥的例數(shù)為58 例，204 位點(diǎn)突變率為62%（39/58），180 位點(diǎn)突變率為53.4%（31/58），181位點(diǎn)突變率為22.4%（13/58），236 位點(diǎn)突變率為6.8%（4/58）；女性發(fā)生耐藥的例數(shù)為16 例，其中204 位點(diǎn)突變率為50.0%（8/16），180 位點(diǎn)突變率為31.2%（5/16），181 位點(diǎn)突變率為6.25%（1/16）；31～60 歲的患者中，180 位點(diǎn)變異率為61%（22/36），181 位點(diǎn)突變率為22.2%（8/36），204 位點(diǎn)變異率為83.3%（30/36），236 位點(diǎn)變異率為11.1%（4/36）。61 歲以上的患者中，180 位點(diǎn)變異率為45.5% （5/11），181 位點(diǎn)變異率為18.1%（2/11），204 位點(diǎn)變異率為45.5%（5/11），236 位點(diǎn)變異率為0。

HBV P 區(qū)位點(diǎn)突變主要集中在180、181、204和236 位點(diǎn)，其他位點(diǎn)也存在較低比例的變異。不同性別和不同年齡段的患者中，HBV P 區(qū)基因突變率尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。通過(guò)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)位點(diǎn)的突變，可以全面反映P 區(qū)位點(diǎn)的變異情況，為臨床用藥提供重要依據(jù)。應(yīng)當(dāng)指出的是，發(fā)生變異不一定耐藥，只有當(dāng)變異株成為優(yōu)勢(shì)株時(shí)才會(huì)發(fā)生耐藥。

3 討論

人們對(duì)HBV 感染的自然史和由此產(chǎn)生的疾病的治療潛力的認(rèn)識(shí)正在不斷提高。目前，用于乙型肝炎抗病毒治療的藥物一般有兩類(lèi)，一類(lèi)是干擾素（IFN），一類(lèi)是核苷（酸）類(lèi)似物，在我國(guó)準(zhǔn)許臨床治療應(yīng)用的核苷（酸）類(lèi)似物主要有5種，包括LAM，ADV，ETV，LdT 和TDF［5］。核苷（酸）類(lèi)似物在臨床治療應(yīng)用中為抗病毒首選藥物，其治療目的是抑制HBV 復(fù)制并最終阻止或延緩慢性乙型肝炎并發(fā)癥的發(fā)生［6］?，F(xiàn)階段的核苷類(lèi)似物對(duì)病毒的抑制作用是通過(guò)影響反轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)及DNA 的延伸，使病毒的復(fù)制受到抑制而發(fā)揮效用［4］。

如圖2 所示，核苷（酸）類(lèi)似物間存在交叉耐藥點(diǎn)的問(wèn)題。對(duì)于已發(fā)生變異的患者，建議臨床合理的選擇用藥，及時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥突變位點(diǎn)的情況，避免出現(xiàn)多重耐藥而增加治療難度。若已出現(xiàn)多重耐藥，則更應(yīng)該監(jiān)測(cè)其耐藥突變位點(diǎn)，合理優(yōu)化治療方案，避免病情失去控制而進(jìn)一步加重。

圖2 HBV 對(duì)應(yīng)核苷（酸）類(lèi)似物耐藥的基因突變位點(diǎn)

對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行分析得到的結(jié)果揭示耐藥發(fā)生率最高的是LAM，這也與已有文獻(xiàn)報(bào)道LAM 耐藥發(fā)生率高達(dá)65%～70%吻合［7］。在耐藥的處理方面最困難的是多重耐藥的出現(xiàn)。隨著臨床用藥，其他新的耐藥突變模式陸續(xù)出現(xiàn)。本研究中，A181T/V+N236T 位點(diǎn)突變占3 例，其聯(lián)合突變可導(dǎo)致LAM、LdT 和ADV 耐藥，并可顯著降低TDF的抗病毒活性。國(guó)內(nèi)的研究及發(fā)現(xiàn)了2 例rt250V/L，rt20I，rtlS0M 和rt204V，rt202G，rt184I新的突變組合。這種新的突變模式是否也會(huì)引起ETV 耐藥或其他耐藥還需進(jìn)一步驗(yàn)證。其中本次分析的患者中也發(fā)現(xiàn)了L180M+M204V+A181G/C的突變，已有文獻(xiàn)報(bào)道可能對(duì)ETV 耐藥［4］?？傮w分析表明，男性的耐藥率比女性高。年齡上，61歲患者以上在236 位點(diǎn)的突變較少，可以指導(dǎo)臨床用藥。

當(dāng)變異株最終推翻野生株的統(tǒng)治后，耐藥發(fā)展到臨床耐藥階段?；颊哐褐蠬BV DNA 水平會(huì)反彈，最終出現(xiàn)肝功能異常、肝臟組織學(xué)損傷。因此我們?cè)诓《緦W(xué)耐藥階段及基因耐藥階段就應(yīng)該盡早進(jìn)行干預(yù)，及時(shí)阻止病毒學(xué)耐藥向臨床耐藥的惡性方向發(fā)展。更有利于指導(dǎo)用藥，減少多重耐藥突變的發(fā)生。耐藥變異位點(diǎn)的檢測(cè)和用藥期間的監(jiān)測(cè)，可以指導(dǎo)臨床選擇和調(diào)整核苷酸類(lèi)藥物，具有非常重要的臨床價(jià)值。