TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達(dá)及意義

米會(huì)會(huì) 孫斌 陶林 沈亞峰 徐江

牙齦瘤來源于牙周膜及頜骨牙槽突的結(jié)締組織，以牙齦增生為主要表現(xiàn)，切除后易復(fù)發(fā)。根據(jù)病理結(jié)構(gòu)牙齦瘤常分為纖維性、肉芽腫性及血管性3類[1]。牙齦增生與牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs)、上皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)增多有關(guān)。鈣離子阻滯劑(calcium channel bockers，CCB)作為常用降壓藥，隨著我國高血壓患病率的增高，服該類藥物的患者增多，臨床上鈣拮抗劑誘導(dǎo)的牙齦增生已居藥物性牙齦增生(drug-induced gingival overgrowth，DGO)首位[2]。CCB主要通過阻礙心肌和血管平滑肌鈣離子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制鈣離子流入細(xì)胞內(nèi)引起心肌收縮性降低和血管擴(kuò)張，從而降低血壓，而CCB如何引起牙齦增生，目前機(jī)制仍不明確。瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)通道參與許多細(xì)胞病理生理學(xué)變化，與牙齦增生有密切聯(lián)系。TRPA1(瞬時(shí)受體電位通道A1)是非選擇性能透過鈣離子的通道，激活時(shí)主要引起鈣離子內(nèi)流，對(duì)氧化應(yīng)激的多種產(chǎn)物、細(xì)菌毒素敏感[3]，與DGO硝苯地平[4]最相關(guān)。研究已證實(shí)HGFs表達(dá)TRPA1和TRPV1陽離子通道。TRPV4主要介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，已有研究表明TRPV4廣泛表達(dá)于如神經(jīng)、血管心臟和腎臟等組織[5]。本研究探討TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達(dá)，并分析其與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008 年6 月～2018 年6 月手術(shù)切除的牙齦瘤存檔石蠟標(biāo)本201 例。牙齦瘤均經(jīng)病理確診并分型。其中纖維性108 例，肉芽腫性55 例，血管性38 例。另選取48 例來自下頜第三磨牙埋伏阻生拔出術(shù)后的牙齦組織，經(jīng)HE染色后閱片確診，作為正常對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組中，男87 例，女114 例，平均(45.18±15.16) 歲；對(duì)照組中，男22 例，女26 例，平均(38.03±13.16) 歲。2 組患者性別、年齡分布均無明顯差異(P>0.05)。

服用硝苯地平的DGO組納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：①有高血壓病史且服用硝苯地平時(shí)間大于半年；②伴有牙齦增生，上下頜前牙區(qū)嚴(yán)重；③需排除糖尿病等其他全身性疾??；④未同時(shí)服用苯妥英鈉、環(huán)孢素A等其他引起牙齦增生的藥物；⑤近半年未接受過牙周基礎(chǔ)治療；⑥手術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)無抗生素服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療期間換用非鈣離子阻滯劑類降壓藥物者；②口服避孕藥者；③由非鈣詰抗類藥物(如苯妥英鈉、環(huán)胞菌素-A)引起的牙齦增生者。

1.2 主要試劑

TRPA1抗體(ab62053，1∶200)、TRPV4抗體(ab94868，1∶100)(Abcam公司，英國)；免疫組化試劑盒(封閉液、二抗、SAB復(fù)合物以及DAB顯色試劑)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法檢測(cè)。步驟：將牙齦組織標(biāo)本固定包埋后切片，脫蠟后EDTA修復(fù)抗原，3%H2O2孵育。BSA處理后分別加入一抗覆蓋組織，以PBS為陰性對(duì)照4 ℃過夜后加入相應(yīng)種屬的二抗，孵育漂洗后加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色(陽性染色為棕黃色)。顯色完全后沖洗切片，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水反藍(lán)。將干燥透明后的切片封固待觀察。

1.4 結(jié)果判定

由2 名病理科副主任醫(yī)師分別單盲法閱片。采用判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)比例及著色深淺進(jìn)行計(jì)分，以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕黃色為陽性，根據(jù)著色的強(qiáng)弱程度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)定和分析。積分?jǐn)?shù)=陽性染色細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。陽性染色細(xì)胞百分比判定標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)標(biāo)本都隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比(陽性細(xì)胞百分率):<5%為0 分；6%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；>75%為4 分。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)為：無著色為0 分；淡黃色為1 分；黃色為2 分；棕黃色為3 分；棕褐色為4 分。陽等級(jí)：1～4為陰性(-)；5～8 分為弱陽性(+)；9～12 分為陽性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TRPA1和TRPV4在牙齦瘤和正常組織的表達(dá)

正常牙齦組織中，TRPA1和TRPV4的表達(dá)多為弱陽性或陰性，主要表達(dá)于上皮基底層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)(圖 1)。在牙齦瘤中，TRPA1和TRPV4表達(dá)于表皮全層及間質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖 2)。TRPA1和TRPV4陽性表達(dá)率分別為56.72%(114/201)和88.56%(178/201)，正常組陽性表達(dá)率分別為35.42%(17/48)和66.67%(32/48)，牙齦瘤組明顯高于正常組(P<0.05)(表 1)。

圖 1 TPRA1和TPRV4在正常組織中的表達(dá)(×200)

2.2 TRPA1和TRPV4表達(dá)與牙齦瘤患者臨床參數(shù)之間關(guān)系

TRPA1和TRPV4表達(dá)與牙齦瘤患者臨床參數(shù)之間關(guān)系見表 2。TRPA1和TRPV4表達(dá)與牙齦瘤患者年齡呈顯著相關(guān)(P值分別為0.000、0.006)，且年齡越大，TRPA1和TRPV4表達(dá)越低。TRPA1和TRPV4表達(dá)與是否為藥物性牙齦增生顯著相關(guān)(P<0.001)，相比之下，二者均在非藥物性牙齦增生中表達(dá)較高，在藥物性牙齦增生中表達(dá)低。TRPA1和TRPV4表達(dá)與患者性別無關(guān)(P>0.05)；TRPA1表達(dá)與牙齦瘤患者病理分型無關(guān)(P>0.05)，而TRPV4表達(dá)與病理分型相關(guān)(P<0.05)，以血管性牙齦瘤陽性率最高95.35%(41/43)，其次是纖維性牙齦瘤92.59%(100/108)，肉芽腫性牙齦瘤陽性率較低74.00%(37/50)。

圖 1 TRPA1和TRPV4在牙齦瘤組織中的表達(dá)×200)

表 1 TRPA1與TRPV4在牙齦瘤和正常組織中的表達(dá)

表 2 TRPA1與TRPV4在牙齦瘤中的表達(dá)與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關(guān)性

牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關(guān)性見表 3。牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.486，P<0.001)。

表 3 牙齦瘤組織中TRPA1和TRPV4的相關(guān)性

3 討 論

TRP通道于1969 年首次在果蠅的視覺系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[8]，是非選擇性陽離子通道，廣泛分布于多種生物中?？杀欢喾N刺激激活，如機(jī)械牽張[9]、溫度變化[10]、氧化應(yīng)激[11]和炎性因子等，繼而激活下游相關(guān)陽離子通路，參與細(xì)胞舒縮、增殖及分化等多種病理生理功能。不同的TRP通道對(duì)鈣離子、鎂離子、鈉離子、氫離子等離子的通透選擇性不一樣。TRPA1激活后可以增加細(xì)胞外陽離子，如鈉離子、氫離子，尤其是引起鈣離子的內(nèi)流，從而在氧化反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和血管擴(kuò)張等過程中發(fā)揮重要作用。TRPA1主要在背根神經(jīng)、三叉神經(jīng)和迷走神經(jīng)的初級(jí)感覺神經(jīng)元中表達(dá)[12]。近年研究表明，大量非神經(jīng)細(xì)胞也存在TRPA1的表達(dá)，如肺成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、牙髓成纖維細(xì)胞和牙本質(zhì)細(xì)胞等[13-15]。López-González等[16]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TRPA1、TRPV1及TRPV1b在人牙齦成纖維細(xì)胞中表達(dá)。這與本實(shí)驗(yàn)中TRPA1在正常牙齦組織中表達(dá)結(jié)果一致。TRPV4廣泛表達(dá)于感覺、消化、呼吸、心血管等系統(tǒng)，參與多種生理及病理過程。TRPV4可被溫度、剪切力、滲透壓等理化刺激激活，可引起鈣離子、鈉離子的流動(dòng)，并主要通過對(duì)鈣離子的調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生異構(gòu)體等不同連接方式，影響細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[17]。與正常組織細(xì)胞比，TRPV4在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如肝癌、胃癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等[17]；極少數(shù)情況下呈低表達(dá)，如前列腺癌和食管癌[18]。

目前，TRP通道在口腔疾病中的相關(guān)研究極少。EI等[19]發(fā)現(xiàn)人類齲齒大量表達(dá)成牙本質(zhì)細(xì)胞。Kun等[20]研究發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)中TRPA1 mRNA高表達(dá)。相反，Tazawa等[21]在新鮮分離的天然成牙本質(zhì)細(xì)胞或牙髓組織中未發(fā)現(xiàn)TRPA1 mRNA，他們推測(cè)可能因?yàn)檠芯恐兴x牙齒均無炎癥，以致TRPA1表達(dá)太低而無法檢測(cè)到，而齲齒的成牙本質(zhì)細(xì)胞感染和炎癥改變了成牙本質(zhì)細(xì)胞特性和TRPA1通道表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)TRPA1在牙齦瘤中的表達(dá)顯著高于正常組織，考慮牙齦瘤主要是炎癥刺激等因素產(chǎn)生的，而正常組織中炎癥因子極少，因而TRPA1表達(dá)較低，或者不表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，牙齦瘤中TRPV4的表達(dá)亦顯著高于正常牙齦組織。李孝瓊等[22]，通過阻滯TRPV4，能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)用增殖表皮癌細(xì)胞)增殖，并推測(cè)TRPV4在宮頸癌HeLa細(xì)胞異常增殖中可能具有負(fù)向調(diào)控作用。Yamada等[23]研究表明，TRPV4高表達(dá)后刺激肝星狀細(xì)胞增殖，進(jìn)而間接誘發(fā)肝癌。相較于TRPA1在口腔中的研究進(jìn)展，TRPV4則鮮有報(bào)道。而TRPV4作為TRPVs家族中的一員，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRPV4在牙齦瘤中高表達(dá)，在正常牙齦組織中也有表達(dá)，主要表達(dá)在上皮基底層細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞中。

本研究發(fā)現(xiàn)TRPA1和TRPV4表達(dá)均與牙齦瘤患者性別無關(guān)，但二者均與年齡及是否為藥物性牙齦增生顯著相關(guān)。且本研究發(fā)現(xiàn)TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中表達(dá)呈正相關(guān)。本研究入選的藥物性牙齦增生患者以服用鈣離子阻滯劑的高血壓患者為主，國外資料顯示鈣通道阻滯劑引起藥物性牙齦增生患病率為15%～85%，國內(nèi)學(xué)者報(bào)道為20%[24]。鈣通道阻滯劑的藥理學(xué)機(jī)制是：作用于冠狀血管和周圍平滑肌細(xì)胞，且能夠選擇性阻滯細(xì)胞膜鈣通道，阻止鈣離子內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)可利用鈣離子[25]。作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，鈣離子濃度變化引起細(xì)胞功能明顯改變，而TRPA1和TRPV4均是以鈣離子為主要透過性陽離子通道，推測(cè)鈣離子阻滯劑類藥物對(duì)兩通道均有抑制作用，從而導(dǎo)致TRPA1和TRPV4在在非藥物性牙齦增生中表達(dá)顯著高于藥物性牙齦增生，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繼而為探索藥物性牙齦增生的機(jī)制提供新可能。而隨著老齡化社會(huì)的進(jìn)入，高血壓患者逐漸增多，服用鈣離子阻滯劑的患者也逐漸增加，因此，當(dāng)年齡越大，藥物性牙齦增生患者相對(duì)越多，則TRPA1和TRPV4表達(dá)就相對(duì)越低，恰與藥物性牙齦增生表達(dá)較低結(jié)果一致。

本研究中，TRPA1表達(dá)與牙齦瘤患者病理分型無關(guān)，而TRPV4表達(dá)與之相關(guān)，且在血管性牙齦瘤中表達(dá)最高，肉芽腫性牙齦瘤中表達(dá)最低，推測(cè)可能與TRPV4在血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)有關(guān)。研究表明TRPA1基因最初是從人成纖維細(xì)胞中克隆的[26]然后在一部分神經(jīng)纖維[27-28]中確定，而肺成纖維細(xì)胞中僅檢測(cè)到TRPA1的表達(dá)[29]。研究表明TRPV4主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和II型肺泡細(xì)胞中，少量表達(dá)于巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎細(xì)胞[30-31]。而肉芽腫性牙齦瘤中以大量炎細(xì)胞及部分新生血管為主，血管性牙齦瘤則以大量成熟血管為主，伴少量炎細(xì)胞。

本研究通過對(duì)TRPA1和TRPV4在牙齦瘤中的表達(dá)以及與牙齦瘤患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)TRPA1和TRPV4均在牙齦瘤中高表達(dá)，提示二者可能與牙齦瘤發(fā)生相關(guān)，其具體機(jī)制有待研究。