TiO2納米管表面對(duì)成骨細(xì)胞與巨噬細(xì)胞黏附、形態(tài)及遷移的影響

劉婧 孫華 何奕德 宋文 張玉梅

鈦種植體因其良好的生物相容性和機(jī)械性能而廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域。為了獲得更加快速、穩(wěn)固的骨結(jié)合，鈦表面改性成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。鈦表面的納米管形貌可模擬天然骨組織中的納米晶體結(jié)構(gòu)，具有促成骨、調(diào)節(jié)骨免疫等生物學(xué)效應(yīng)[2-3]，但其對(duì)不同類型細(xì)胞的調(diào)控機(jī)理仍不明確。研究表明，細(xì)胞黏附、遷移等行為特征是其增殖、分化并發(fā)揮功能的前提和基礎(chǔ)。成骨細(xì)胞的成骨分化與細(xì)胞的黏附和增殖密切相關(guān)，而巨噬細(xì)胞的黏附及形態(tài)則影響其極化的方向和免疫調(diào)控功能的發(fā)揮[4-5]。因此，本研究通過陽極氧化法在鈦表面制備納米管形貌，分別研究了其對(duì)成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的早期黏附、細(xì)胞形態(tài)和遷移運(yùn)動(dòng)的影響，為進(jìn)一步理解納米形貌調(diào)控細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)理及種植體表面形貌設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

純鈦片(10 mm×10 mm×1.5 mm，西北有色金屬研究院)；碳化硅砂紙(STARCKE,德國)；無水乙醇、丙酮、氫氟酸(天津富宇精細(xì)化工有限公司)；戊二醛(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；Hoechst33342(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ɑ-MEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(Sigma，美國)；磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 主要儀器

超聲波清洗器(KQ250B，昆山市超聲波儀器有限公司)；陽極氧化電源(MATSUSADA，日本)；磁力加熱攪拌器(上海帥登儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；掃描電子顯微鏡(S-4800，Hitachi，日本)；熒光顯微鏡(IX71)、活細(xì)胞工作站(IX81-ZDC)(Olympus,日本)。

1.3 鈦試樣制備及表征

方形鈦片經(jīng)800～5000 目碳化硅砂紙序列打磨拋光后，得到表面光滑的鈦試樣(P)并將其作為對(duì)照組；在20 V電壓下及含0.5%氫氟酸溶液的電解液中，以表面光滑的純鈦試樣為陽極，石墨電極為陰極，陽極氧化1 h，得到表面有TiO2納米管的鈦試樣(NT)并將其作為實(shí)驗(yàn)組。將制備好的鈦試樣依次經(jīng)丙酮、無水乙醇、去離子水超聲蕩洗并真空干燥后，于場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌。所有試樣在接種細(xì)胞前，均使用75 %乙醇浸泡及紫外線照射消毒。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(ATCC,美國)用含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的ɑ-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48 h換液1 次；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(ATCC,美國)用含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24 h換液1 次。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80%左右時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

將P組和NT組鈦試樣置于24 孔板中，將成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞按2×104個(gè)/孔的密度分別接種于各組鈦試樣表面，在接種3、6、12、24、48 h后終止培養(yǎng)。PBS漂洗細(xì)胞3 次，2.5%戊二醛固定過夜，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水10 min，六甲基二硅胺烷再脫水30 min，真空干燥后即刻噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 細(xì)胞黏附計(jì)數(shù)

細(xì)胞接種方法同1.5，分別在細(xì)胞接種3、6、12、24 h時(shí)終止培養(yǎng)，PBS漂洗3 次，4%多聚甲醛固定過夜，Hoechst 33342染色后熒光顯微鏡下拍照，使用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.7 細(xì)胞遷移軌跡追蹤

細(xì)胞接種方法同1.5，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)移至活細(xì)胞工作站內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每30 min拍照1 次，連續(xù)拍照24 h，將所得細(xì)胞時(shí)間序列圖像生成視頻，并經(jīng)Image J軟件處理得到細(xì)胞遷移軌跡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鈦試樣表面形貌觀察

掃描電鏡放大1 000 倍后可見，P組鈦表面較為光滑，僅有少量劃痕，NT組鈦表面為云霧狀形態(tài)；放大100 000 倍后可見，P組鈦表面光滑無雜質(zhì)，NT組鈦表面為均勻排列的直徑約80 nm的納米管陣列(圖 1)。

圖 1 鈦試樣表面形貌

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

SEM觀察顯示：成骨細(xì)胞在2 組鈦試樣表面的細(xì)胞鋪展均為不規(guī)則的多邊形。NT組表面細(xì)胞邊緣多為鋸齒狀且絲狀偽足豐富，而P組表面細(xì)胞邊緣較為光滑，多為板狀偽足。巨噬細(xì)胞在2 組試樣表面形態(tài)均近似為球形，細(xì)胞伸出絲狀偽足。NT組表面細(xì)胞偽足較短且稀少，而P組表面細(xì)胞偽足較長且豐富(圖 3)。

2.3 細(xì)胞黏附統(tǒng)計(jì)

如圖 2所示。成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在鈦試樣表面的黏附數(shù)量均隨著時(shí)間的延長而增多；在相同時(shí)間點(diǎn)，成骨細(xì)胞的黏附數(shù)量為NT組>P組，巨噬細(xì)胞的黏附數(shù)量為NT組

圖 2 細(xì)胞接種試樣表面3、6、12、24 h后細(xì)胞核熒光染色和定量分析(×40)

圖 3 細(xì)胞接種試樣表面3、6、12、24、48 h后的形態(tài)學(xué)觀察

2.4 細(xì)胞遷移軌跡及速率統(tǒng)計(jì)

成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在鈦試樣表面均為無特定方向的不規(guī)則運(yùn)動(dòng)，但二者在不同形貌鈦試樣表面的遷移速率有所差異：成骨細(xì)胞在納米管形貌上較光滑鈦表面遷移緩慢，而巨噬細(xì)胞在納米管形貌上較光滑鈦表面遷移更為迅速(圖 4)。

圖 4 細(xì)胞在鈦試樣表面的遷移軌跡

3 討 論

鈦種植體表面改性可以加快種植體植入體內(nèi)后的骨愈合過程，縮短種植周期。常用的方法有噴砂酸蝕、激光處理、陽極氧化、涂層技術(shù)等[1]。本研究采用陽極氧化法，通過控制電壓及陽極氧化的時(shí)間在鈦表面制備了管徑均一的納米管形貌。該方法操作簡便，可重復(fù)性強(qiáng)，為后續(xù)的細(xì)胞行為學(xué)評(píng)價(jià)提供了穩(wěn)定可靠的材料模型。之后探討了成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在不同形貌鈦表面的黏附、形態(tài)及遷移運(yùn)動(dòng)的差異。

種植體的骨愈合過程涉及多種細(xì)胞的參與。種植體植入后，其表面迅速吸附纖維蛋白并形成血痂。之后，血液中的中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞遷移至此發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。干細(xì)胞、成骨細(xì)胞黏附在種植體表面并不斷分化形成新骨，破骨細(xì)胞在骨愈合中后期發(fā)揮著骨改建作用。種植體表面形貌的不同會(huì)影響細(xì)胞的行為；不同的細(xì)胞種類由于其所行使功能的不同，對(duì)同一種表面形貌的反應(yīng)也會(huì)有所區(qū)別。研究表明，成骨細(xì)胞能夠在納米管表面快速黏附增殖并伸出大量絲狀偽足，該絲狀偽足可以幫助其錨定在納米管上[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞在納米管表面的黏附能力明顯強(qiáng)于光滑鈦表面，納米管表面細(xì)胞的絲狀偽足更為豐富，光滑表面細(xì)胞則有較多的邊緣光滑的板狀偽足，這與前述研究結(jié)果一致[9]。細(xì)胞的黏附依賴于黏著斑的形成。由于納米管的中空結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)主要吸附于納米管管壁，為細(xì)胞黏著斑提供錨定位點(diǎn)[10]。成骨細(xì)胞的細(xì)長絲狀偽足可能是為了不斷伸展以尋找更合適的黏附位點(diǎn)[11]。與成骨細(xì)胞不同，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在納米管表面的黏附數(shù)量及絲狀偽足數(shù)量相較于光滑表面顯著降低。有研究認(rèn)為，鈦基底經(jīng)納米管修飾后表面親水性和負(fù)電性升高[12-13]，而帶負(fù)電的親水性生物材料表面能夠抑制單核-巨噬細(xì)胞的黏附且促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附[14-15]。產(chǎn)生該現(xiàn)象可能的原因是親水性和負(fù)電性的材料表面缺乏巨噬細(xì)胞黏附和伸展所需的整合素結(jié)合位點(diǎn)[16-17]。

本研究比較了細(xì)胞在不同形貌的鈦表面遷移運(yùn)動(dòng)的差異。由于成骨細(xì)胞在納米管表面黏附能力較強(qiáng)，其遷移速率明顯較光滑表面的細(xì)胞緩慢。相反的，納米管表面的巨噬細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)更為明顯。細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)是需要細(xì)胞形態(tài)高度協(xié)調(diào)變化，同時(shí)與其細(xì)胞外基質(zhì)不斷相互作用的過程。該過程可以分為4 個(gè)獨(dú)立的步驟：細(xì)胞前緣伸展并黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞骨架收縮并產(chǎn)生牽引力，細(xì)胞后緣黏附斑的解聚和細(xì)胞體的移動(dòng)[18]。由此可見，細(xì)胞的遷移能力是與細(xì)胞黏附密切相關(guān)的，細(xì)胞黏附力越強(qiáng)，細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)則越少。另外，細(xì)胞的遷移和分化是兩個(gè)相互競爭的過程[19]，成骨細(xì)胞的遷移停止以及有效的黏附定植，有利于細(xì)胞進(jìn)行下一步的成骨分化[20]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也在一定程度上也解釋了納米管形貌表面具有更好的促成骨效應(yīng)的原因[21]。近年來，通過材料表面的納米形貌控制細(xì)胞的黏附和遷移行為，進(jìn)而調(diào)控其功能發(fā)揮，成為材料表面修飾的熱點(diǎn)[20]。細(xì)胞通過黏著斑等黏附相關(guān)蛋白與材料直接接觸，能夠感知基底形貌的差異并作出相應(yīng)的反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)納米形貌表面的成骨細(xì)胞黏附能力更強(qiáng)，遷移速率更低，而巨噬細(xì)胞則與之相反，其內(nèi)在機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。