植入不同皮質(zhì)骨厚度區(qū)域微種植體骨整合的組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)研究

吳也可 趙立星 郜然然

微種植體被常規(guī)用于支抗加強(qiáng),盡管微種植體在正畸治療結(jié)束后就去除，但微種植體因植體斷裂或松動(dòng)造成的失敗率為0%～30%[1]。微種植體的初期穩(wěn)定性即植入后的即刻穩(wěn)定性，主要由微種植體周圍皮質(zhì)骨的質(zhì)和量決定。二期穩(wěn)定性，指骨和微種植體接觸界面骨的狀況，由骨整合(osseointegration，OI)獲得。良好的初期穩(wěn)定性是獲得較高二期穩(wěn)定性和存活率的基礎(chǔ)。

近期，學(xué)者們關(guān)注不同根間區(qū)域的皮質(zhì)骨厚度(cortical bone thickness，CBT)，并提出微種植體植入最佳位點(diǎn)的臨床指南[2-4]。骨的質(zhì)和量對(duì)于正畸微種植體的初期穩(wěn)定性乃至長(zhǎng)期成功率至關(guān)重要[5]。研究者證實(shí)CBT值與微種植體成功率呈正相關(guān)，提示1 mm為改善微種植體成功率的臨床CBT閾值[6]。作者前期研究表明，植入較厚CBT區(qū)域比植入較薄者的無應(yīng)力載荷的微種植體在愈合早期具有更高穩(wěn)定性[7]。上頜骨比下頜骨具有相對(duì)較薄的皮質(zhì)骨。相關(guān)研究亦表明植入下頜骨的微種植體初期穩(wěn)定性和成功率比上頜骨更高[8]。然而，一些人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道卻得出相反結(jié)論[9]。作者也發(fā)現(xiàn)植入后7 周，上頜骨比下頜骨能獲得更高的OI和穩(wěn)定性[10]?；谂R床經(jīng)驗(yàn)和本課題組前期研究，猜想在不同CBT組微種植體的穩(wěn)定性和OI值顯著不同。

綜上，本研究擬運(yùn)用Micro-CT、拉拔試驗(yàn)和多重?zé)晒庑蛄袠?biāo)記法探討不同愈合時(shí)間CBT對(duì)應(yīng)力加載下正畸微種植體穩(wěn)定性和OI的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及微種植體植入

將48枚微種植體(長(zhǎng)度6 mm，直徑1.6 mm，Medicon公司，德國(guó))植入12 只成熟骨齡Beagle犬(23 月齡，平均體質(zhì)量11.7 kg)兩側(cè)脛骨，每個(gè)脛骨2 枚。動(dòng)物由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均健康。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物均經(jīng)過系統(tǒng)和局部麻醉。鈍性分離暴露脛骨骨面，切口遠(yuǎn)離術(shù)區(qū)，在脛骨近端干骺端植入2 枚微種植體，均在脛骨粗隆下方，分別距離干骺端2 cm和4 cm。CBT從脛骨末端到中心逐漸增加，即每個(gè)脛骨上的2 枚微種植體分別植入距干骺端2 cm處(薄CBT組，n=24)和距干骺端4 cm處皮質(zhì)骨區(qū)域(厚CBT組,n=24)(圖 1A)。植入術(shù)后即刻于干骺端一側(cè)2 枚微種植體間安置鎳鈦螺旋拉簧，加載2 N的力(圖 1B)。微種植體植入后1、3、5、7 周處死動(dòng)物。

A: 2 枚微種植體植入脛骨近端干骺端的脛骨粗隆側(cè)； B: 植入后，在2 個(gè)微種植體間用鎳鈦螺旋拉簧加載2 N應(yīng)力

為評(píng)估微種植體植入后的骨重塑，用序列染色：植入后1 周，靜脈注射四環(huán)素(20 mg)，3周靜注鈣黃綠素(8 mg)，5 周靜注二甲苯橙(120 mg)。

1.2 檢測(cè)樣本制備

用過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，取下帶微種植體的脛骨，用渦輪機(jī)將標(biāo)本修整成組織塊，要求每個(gè)組織塊包含一枚種植釘和其周圍至少5 mm不含軟組織的骨質(zhì)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)骨塊上方近中端和遠(yuǎn)中端的皮質(zhì)骨厚度。經(jīng)多重?zé)晒庑蛄腥旧臉?biāo)本用5%戊二醛固定1 周，梯度酒精和氯仿輪流脫水，然后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋。用顯微薄片切片機(jī)(SP 1600，Leica公司,德國(guó))低速(0.4 mm/min)將包埋的骨樣本沿與微種植體長(zhǎng)軸平行方向切片。其他骨/微種植體塊用10%福爾馬林溶液4 ℃固定。

1.3 Micro-CT檢測(cè)

樣本固定2 周后，按照以前報(bào)道方案進(jìn)行Micro-CT(CT80,Scanco Medical公司,瑞士)檢測(cè)[11]。計(jì)算以下形態(tài)學(xué)參數(shù)：松質(zhì)骨體積密度(骨體積/總體積)(BV/TV)，相交表面(與微種植體接觸的骨表面)(IS)。微種植體的骨整合(OI)由IS與骨內(nèi)微種植體表面積的比值計(jì)算而來。

1.4 生物力學(xué)拉拔試驗(yàn)

Micro-CT分析以后，在材料測(cè)試系統(tǒng)(Instron 5565，Instron公司,美國(guó))上進(jìn)行拉拔試驗(yàn)(圖 2)[11]。監(jiān)測(cè)施加應(yīng)力及拉拔峰值載荷(Fmax)。

1.5 熒光顯微觀察和組織形態(tài)學(xué)分析

對(duì)多重?zé)晒庑蛄腥旧臉颖?，沿微種植體長(zhǎng)軸切制200 μm厚硬組織切片。選取最接近長(zhǎng)軸中點(diǎn)的3 張切片(共144 張)，在熒光顯微鏡(IX71；Olypus公司,日本)下觀察骨。用裝有圖形分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus，Media Cybernetics公司,美國(guó))的熒光顯微鏡拍攝顯微圖片，對(duì)愈合期間沉積于微種植體兩側(cè)的四環(huán)素、鈣黃綠素和二甲苯橙進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用方差分析比較組間組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)參數(shù)差異，不同時(shí)間點(diǎn)薄CBT和厚CBT組的均值用SNK-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 種植體植入成功率及相關(guān)影像

各組微種植體植入成功率為100%，所有微種植體在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均保持穩(wěn)定，未見松動(dòng)脫落。在各時(shí)間點(diǎn)，2 種植入位點(diǎn)的CBT差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表 1)。顯微CT的高分辨率斷層圖像清晰顯示了骨-種植體界面，確定了與種植體相接觸的骨組織并量化了OI，并且觀察到微種植體周圍皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨內(nèi)骨小梁有不同程度的吸收(圖 3～4)。

2.2 生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)

圖 2 測(cè)試儀器 圖 3 顯微CT分析儀三維重建

圖 4 微種植體周圍松質(zhì)骨：含有中等松質(zhì)骨體積密度值的代表性樣本

表 1 微種植體植入位點(diǎn)的皮質(zhì)骨厚度

植入后1 周，薄CBT組OI、BV/TV、IS和Fmax4 個(gè)指標(biāo)均較厚CBT組低(P<0.05)。薄CBT組OI值為22.64%，厚CBT組為38.73%。拉拔試驗(yàn)結(jié)果顯示，薄CBT組Fmax為261.27 N，厚CBT組為373.35 N(P<0.05)。植入后1～3 周，薄CBT組3個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯著增加(P<0.05)，F(xiàn)max略有增加(P>0.05)。而在厚CBT組，上述4個(gè)指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。植入后3周，厚CBT組所有指標(biāo)仍顯著高于薄CBT組(P<0.05);植入后5 周，隨愈合時(shí)間延長(zhǎng)，薄CBT組形態(tài)學(xué)指標(biāo)持續(xù)上升，開始顯著高于厚CBT組(P<0.05)。厚CBT組Fmax開始略有增加，但第5周和第3周相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。薄CBT組生物力學(xué)指標(biāo)仍低于厚CBT組(P<0.05)。植入后7 周，厚和薄CBT組4個(gè)指標(biāo)均較第5周有所提升。其中薄CBT組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，厚CBT組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2 組間相比，厚CBT組的值仍高于薄CBT組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些檢測(cè)指標(biāo)總體變化趨勢(shì)呈時(shí)間依賴性(圖 5)。

2.3 骨重塑及骨整合

熒光顯微鏡分析結(jié)果表明在所有骨/微種植體切片均有明顯骨重塑和骨整合。新形成的骨被多重?zé)晒庑蛄腥旧珮?biāo)記，鈣黃綠素為較窄綠線，二甲苯橙為紅色條帶，四環(huán)素為彌散黃染形式。松質(zhì)骨較皮質(zhì)骨能更明顯觀察到多重?zé)晒庑蛄腥旧?。在松質(zhì)骨的部分區(qū)域，二級(jí)骨單位表現(xiàn)為松質(zhì)骨周圍同心圓狀沉積的標(biāo)記物(圖 6)。在薄CBT組微種植體兩側(cè)能見到比厚CBT組更多的骨重塑。

表 2顯示3 條最好的種植體螺紋內(nèi)不同位點(diǎn)3 種熒光標(biāo)記的沉積面積測(cè)量結(jié)果。薄CBT組壓力側(cè)值最大，而厚CBT組張力側(cè)值最小。方差分析表明薄CBT組顯著高于厚CBT組(P<0.05)。薄CBT組2 個(gè)表面的鈣黃綠素沉積量均顯著高于二甲苯橙和四環(huán)素(P<0.05)。在厚CBT組，四環(huán)素沉積面積顯著低于其余2 種標(biāo)記(P<0.05)，但鈣黃綠素和四環(huán)素間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖 6 骨重塑和骨整合(熒光顯微鏡，×100)

表 2 多重?zé)晒庑蛄袠?biāo)記的沉積面積

Tab 2 Deposition area of the polyfluorochrome sequential labeling (mm2,

表 2 多重?zé)晒庑蛄袠?biāo)記的沉積面積

標(biāo)記沉積面積壓力側(cè)張力側(cè)四環(huán)素鈣黃綠素二甲苯橙四環(huán)素鈣黃綠素二甲苯橙薄CBT組29.71±0.92188.23±12.79104.96±7.722.47±0.2282.56±4.1290.31±6.04厚CBT組10.55±1.16113.15±9.5276.21±4.541.68±0.1455.70±4.6364.47±5.91

3 討 論

由于微種植體解剖學(xué)限制較小，可根據(jù)正畸治療的需要選擇上頜骨或下頜骨很多位點(diǎn)植入，比如顴牙槽嵴、下頜骨外斜線、牙間/根間區(qū)以及前后牙槽突[12]。這些植入位點(diǎn)的CBT隨解剖結(jié)構(gòu)不同而異。脛骨具備規(guī)則的外形、皮/松質(zhì)骨分界清楚、從干骺端到骨中段皮質(zhì)骨厚度逐漸增加等典型長(zhǎng)骨的解剖學(xué)特點(diǎn)，分別選擇鄰近脛骨干骺端和毗鄰脛骨中段的區(qū)域作為薄和厚CBT組植入位點(diǎn)，并在不同CBT位點(diǎn)2個(gè)微種植體之間即刻加載2 N的應(yīng)力。這樣排除了復(fù)雜口腔環(huán)境等干擾因素的影響，以便精準(zhǔn)探討不同CBT對(duì)應(yīng)力加載下微種植體穩(wěn)定性的作用。

本研究綜合運(yùn)用了顯微CT、拉拔試驗(yàn)和多重?zé)晒庑蛄袠?biāo)記實(shí)驗(yàn)來衡量植入2 個(gè)不同CBT位點(diǎn)微種植體的穩(wěn)定性。其中，顯微CT掃描顯示了骨和種植體界面的三維高分辨形態(tài)學(xué)信息，比傳統(tǒng)組織形態(tài)學(xué)分析提供了更精確的數(shù)據(jù)。然而，當(dāng)界面有新的骨和軟骨形成時(shí)，顯微CT難以顯示類骨質(zhì)，計(jì)算所得OI值可能比實(shí)際偏低。因此，尚需生物力學(xué)拉拔試驗(yàn)檢測(cè)微種植體的固位力以驗(yàn)證顯微CT參數(shù)。另外，為了更好理解微種植體周圍的骨重塑情況，本研究還參考Lopes等[13]報(bào)道的方案進(jìn)行了多重?zé)晒庑蛄袠?biāo)記實(shí)驗(yàn)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出以下幾點(diǎn)：①植入后3周是骨重塑的關(guān)鍵階段；②在不同階段皮質(zhì)骨形成顯著少于松質(zhì)骨，提示皮質(zhì)骨骨重塑活性相對(duì)較低；③薄CBT組松質(zhì)骨形成顯著多于厚CBT組，其機(jī)制可能是較薄皮質(zhì)骨相對(duì)更有利于機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)進(jìn)入其下松質(zhì)骨，且薄CBT組密集分布呈編織狀結(jié)構(gòu)的松質(zhì)骨可能也有利于更多新骨形成；④微種植體壓力側(cè)骨形成顯著多于張力側(cè)，更提示機(jī)械應(yīng)力正性調(diào)控骨重塑。

本研究發(fā)現(xiàn)植入較厚皮質(zhì)骨的微種植體獲得了更高的初期穩(wěn)定性，與很多研究結(jié)果一致[6-8]。推測(cè)原因如下：①薄CBT區(qū)域松質(zhì)骨分布越密集，熒光標(biāo)記顯示骨礦化越好，越有利于獲得高的二期穩(wěn)定性；②微種植體植入皮質(zhì)骨造成的損傷，因較差的血供和較低的再生能力，導(dǎo)致厚CBT組植入后OI%和Fmax有所降低；③厚CBT區(qū)域的形變能力較薄CBT更弱，導(dǎo)致對(duì)骨重塑很重要的機(jī)械應(yīng)力難以傳導(dǎo)進(jìn)入其下的松質(zhì)骨。研究結(jié)果提示正畸微種植體對(duì)初期穩(wěn)定性的要求并不高，與之前牙科種植體的觀點(diǎn)相悖。原因可能是牙科種植體承受各方向較大應(yīng)力，而正畸微種植體僅負(fù)荷單一方向較小的力，過高的初期穩(wěn)定性并非必要。鑒于正畸牙移動(dòng)的適宜力值為0.3～4 N，遠(yuǎn)低于本研究采用的拉拔力，建議微種植體在任何治療階段均可負(fù)載正畸施力強(qiáng)度(0.3～4 N)[14]。正畸臨床使用臨時(shí)性支抗裝置，最主要考慮的是植入部位應(yīng)選擇有充足松質(zhì)骨量、血供豐富的解剖安全區(qū)域[15]。

4 結(jié) 論

厚皮質(zhì)骨區(qū)域植入的微種植體具有更高的初期穩(wěn)定性，薄皮質(zhì)骨區(qū)域的微種植體隨時(shí)間延長(zhǎng)穩(wěn)定性顯著增加，后期二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？剂恐踩刖植康墓菞l件，采用適宜的加載方式對(duì)成功治療至關(guān)重要。