• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    平喘顆粒對氣道上皮細(xì)胞自噬及凋亡的抑制作用探討?

    2020-12-06 12:10:32蔣鵬娜王麗潔李竹英
    中國中醫(yī)急癥 2020年11期
    關(guān)鍵詞:雷帕氯喹平喘

    蔣鵬娜 王麗潔 李 星 李竹英

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

    支氣管哮喘是由包括氣道炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)在內(nèi)的多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。哮喘的病理生理狀態(tài)研究較多的主要有:氣道重塑、氣道炎癥、黏液蛋白過度分泌和氧化應(yīng)激過度[2]。近些年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病中作用機(jī)制的不斷被挖掘,許多學(xué)者證實(shí)了自噬主要通過調(diào)節(jié)基因[3]、氧化應(yīng)激、T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)[4]、病毒侵襲[5]等多方面影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者通過觀察平喘顆粒含藥血清對氣道上皮細(xì)胞自噬及凋亡的影響,以探討該藥的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康清潔級(jí)Wistar大鼠,48只雌雄各半,購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心,許可證號(hào):SYXK(黑)2015-003,體質(zhì)量(200±20)g,雌雄分籠飼養(yǎng),自由飲食,在室溫(22±2)℃、濕度(50±10)%條件下適應(yīng)性喂養(yǎng),觀察大鼠在進(jìn)食、飲水、二便、活動(dòng)方面均無異常,1周后正式進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物與試劑

    平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母共9味藥物組成,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備,規(guī)格10 g/袋,批號(hào)20150102;人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE),購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫(CBP60550);胎牛血清(FBS)來自Sigma公司,雷帕霉素來自上海源葉生物公司,氯喹來自Sigma公司。

    1.3 含藥血清的制備

    取健康清潔級(jí)Wistar大鼠,平喘顆粒連續(xù)給藥3 d(將平喘顆粒稀釋至0.54 g/mL,每次按1 mL/100 g灌胃),末次給藥前禁食12 h,給藥2 h后麻醉,腹主動(dòng)脈取血,采血后靜置30 min,常規(guī)分離血清,56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min,過濾器過濾,密封,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Mㄟ^實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)含藥(平喘顆粒)血清濃度為20%時(shí)[9],對雷帕霉素誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞有較明顯的抑制作用,故實(shí)驗(yàn)中選用該濃度。

    1.4 細(xì)胞分組、加藥及收集

    取對數(shù)生長期的16HBE貼壁細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,將細(xì)胞按照常規(guī)方法接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下細(xì)胞密集度達(dá)到70%時(shí),將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)基細(xì)胞組(正常對照組)、雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組。將雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組分別加入雷帕霉素800 μL,對照組加入等量的DMEM不完全培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12 h后棄去各組培養(yǎng)基,重新將正常對照組、雷帕霉素組分別加入800 μL DMEM不完全培養(yǎng)液,雷帕霉素加氯喹組加入800 μL氯喹溶液,雷帕霉素加中藥組加入800 μL含中藥血清,再次放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h。棄去各組培養(yǎng)液,常規(guī)消化細(xì)胞,分別刮取收集各組細(xì)胞,保存至1.5 mL離心管內(nèi)。

    1.5 電鏡下觀察細(xì)胞自噬

    棄去培養(yǎng)液,常規(guī)消化細(xì)胞,刮取細(xì)胞,分別收集各組細(xì)胞,用戊二醛固定后,按照電鏡操作流程處理細(xì)胞后觀察各組細(xì)胞自噬情況。

    1.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況

    收集培養(yǎng)的細(xì)胞,調(diào)成密度為5×105個(gè)/mL,按照操作流程進(jìn)行流式細(xì)胞檢測,Anneexin V-FITC為綠色熒光,碘化丙啶(PI)為紅色熒光,在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,正常的活細(xì)胞不被Anneexin V-FITC和PI染色;凋亡早期的細(xì)胞僅被Anneexin V-FITC染色,PI染色呈陰性;壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞可以同時(shí)被Anneexin V-FITC和PI染色。散點(diǎn)圖的左上象限是可允許范圍內(nèi)的檢測誤差。

    1.7 Westen blotting方法檢測細(xì)胞中自噬效應(yīng)蛋白-1(Beclin-1)、Caspase-3蛋白表達(dá)

    將準(zhǔn)備就緒的各組細(xì)胞按照BCA蛋白濃度檢測說明書進(jìn)行測定,利用酶標(biāo)儀讀取OD值,在蛋白定量后用還原樣品加熱,使蛋白變性,電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膠片曝光、定影等過程同膠片掃描后分析結(jié)果。檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)基因蛋白Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)水平,并對其條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示,組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 電鏡檢測結(jié)果

    2.1.1 雷帕霉素誘導(dǎo)12 h 16HBE觀察 見圖1。正常對照組中細(xì)胞核染色質(zhì)豐富且均勻,可清晰見到線粒體及完整峭結(jié)構(gòu),細(xì)胞整體形態(tài)良好;經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作用后,其余3組中部分細(xì)胞內(nèi)可見單層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡,內(nèi)含細(xì)胞器腫脹變形,部分線粒體空泡化,峭開始溶解。

    圖1 各組12 h 16HBE電鏡結(jié)構(gòu)圖(25 000倍)

    2.1.2 雷帕霉素誘導(dǎo)后加藥物干預(yù)電鏡觀察 見圖2。正常對照組中細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)及形態(tài)完好,細(xì)胞核染色質(zhì)豐富、分布均勻,胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體,峭較完整;加氯喹干預(yù)后24 h,細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,可見自噬泡,少量線粒體出現(xiàn)峭溶解斷裂;加中藥血清干預(yù)后24 h,細(xì)胞基本形態(tài)較好,可見到自噬泡和線粒體,其中線粒體峭較完整。由圖可見,經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)改變了正常基本結(jié)構(gòu),出現(xiàn)了線粒體腫脹,甚至溶解、空泡化。而分別在氯喹和含藥血清干預(yù)已自噬的細(xì)胞后,其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)均明顯改善,細(xì)胞活力增加,說明由雷帕霉素引起的自噬在氯喹或者中藥平喘顆粒的干預(yù)下可以得到抑制或者改善,從而對細(xì)胞起到保護(hù)作用。

    圖2 各組細(xì)胞電鏡結(jié)構(gòu)圖(25 000倍)

    2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

    見表1,圖3。經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后,16HBE細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均增加(P<0.05)。而經(jīng)氯喹阻斷后,細(xì)胞晚期凋亡率明顯下降(P<0.05),而早期凋亡率下降不明顯(P>0.05),總凋亡率也呈下降趨勢(P<0.05)。經(jīng)平喘顆粒干預(yù)后,細(xì)胞早期凋亡率變化也不明顯(P>0.05),晚期凋亡率明顯下降(P<0.05),總凋亡率也呈下降趨勢(P<0.05)。

    表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    與正常對照組比較,?P< 0.05,??P< 0.01;與雷帕霉素組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同

    組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6早期凋亡率6.135±0.422 10.125±0.635**14.581±1.232**10.056±1.114**晚期凋亡率9.123±0.307 26.843±2.136**12.426±1.667**△△17.011±1.606**△△總凋亡率16.012±0.823 35.266±2.736**26.758±2.697**△△26.903±2.792**△△

    圖3 各組細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果

    2.3 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

    見表2,圖4。結(jié)果顯示,雷帕霉素組和雷帕加氯喹組Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.05或P<0.01),其中雷帕霉素組上述指標(biāo)的表達(dá)較雷帕加中藥組增高(P<0.05)。在雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡中,自噬和凋亡二者相互促進(jìn),Caspase-3蛋白表達(dá)增加,而氯喹和中藥平喘顆粒組Caspase-3蛋白表達(dá)受抑制。

    表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(±s)

    表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(±s)

    組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6 Beclin-1 GAPDH 0.61±0.33 0.82±0.37**0.71±0.29*△△0.43±0.30**△△Caspase-3 GAPDH 0.46±0.27 0.97±0.30**0.55±0.22*△△0.54±0.25*△△

    圖4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

    3 討論

    劉建秋教授根據(jù)多年治療哮喘慢性持續(xù)期或者緩解期的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出了“見痰不治痰,重用溫藥,既化飲又給邪以出路,補(bǔ)中有消,溫中有行,開中有闔”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑,由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子等9味藥物組成。前期臨床研究表明平喘顆粒用于慢性持續(xù)期的陽虛痰盛證哮喘患者治療效果尤佳,亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病[6-7]。在前期平喘顆粒藥效學(xué)研究中該藥物可促進(jìn)小鼠氣管酚紅的排泄量和促進(jìn)呼吸道上皮纖毛運(yùn)動(dòng),促使痰液稀釋并發(fā)揮排痰的作用[8]。也有研究表明哮喘發(fā)病時(shí)引起氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而結(jié)局則是以細(xì)胞重回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞自噬或細(xì)胞凋亡等形式結(jié)束[9]。氣管上皮細(xì)胞的新陳代謝中自噬與凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式,自噬可以促進(jìn)凋亡發(fā)生,又可以通過提供營養(yǎng)和能力發(fā)揮防御作用,抑制凋亡或者延遲凋亡,而在調(diào)控方面,二者又可獨(dú)立發(fā)揮作用,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。Beclin-1作為自噬的直接執(zhí)行者,不僅可促進(jìn)自噬吞噬體形成[11],增加自噬發(fā)生[12],同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡[13]。劉娟等提出在哮喘患者中Beclin-1可能同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡和自噬的過程,調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),緩解哮喘的急性發(fā)作與慢性病程[14]。Caspases又稱凋亡蛋白酶,Caspase-3處于兩條凋亡信號(hào)通路的中心位置,通過介導(dǎo)特異性肽鍵,引起凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15-16],執(zhí)行細(xì)胞最終凋亡過程[17]。國內(nèi)研究表明在嬰幼兒喘息性疾病的研究中[18],嗜酸性粒細(xì)胞中的凋亡因子Caspase-3活性降低,抗凋亡Bcl-2基因表達(dá)增多,在兩者共同作用下導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞凋亡減緩,使得患兒外周血中嗜酸性粒細(xì)胞相對增多。

    本實(shí)驗(yàn)用雷帕霉素[19]誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞自噬,通過電鏡發(fā)現(xiàn)自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)-自噬泡的存在,還觀察到凋亡細(xì)胞,并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況,其結(jié)果均明顯出現(xiàn)自噬和凋亡指征,凋亡率明顯增加,自噬泡及溶酶體增多,凋亡標(biāo)志蛋白酶Caspase-3/Beclin-1表達(dá)均顯著增加,而應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和中藥平喘顆粒后,凋亡率、自噬數(shù)量、Caspase-3、抑凋亡蛋白Beclin-1表達(dá)均明顯下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素激活氣道上皮細(xì)胞自噬途徑后,平喘顆粒有類氯喹作用,在哮喘發(fā)病的自噬過程中對病變細(xì)胞的凋亡與自噬起抑制作用,且此過程中凋亡與自噬二者呈正相關(guān)。

    猜你喜歡
    雷帕氯喹平喘
    Ganoderma lucidum: a comprehensive review of phytochemistry,eff icacy,safety and clinical study
    土壤里長出的免疫抑制劑
    ——雷帕霉素
    食品與健康(2022年8期)2022-10-22 03:06:43
    基于FAERS數(shù)據(jù)庫的氯喹與羥氯喹心臟不良事件分析
    Pingchuan formula (平喘方) improves allergic asthma in mice through inhibiting nuclear factor-kappa B/mitogen-activated protein kinase signaling pathway
    氯喹和羥氯喹藥理特性及新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)治療應(yīng)用
    氯喹和羥氯喹在新型冠狀病毒肺炎治療中的臨床研究進(jìn)展及其心臟毒副作用
    7-氯喹哪啶加合物的制備和溶解性研究*
    廣州化工(2020年5期)2020-03-31 07:43:34
    雷帕霉素在神經(jīng)修復(fù)方面作用機(jī)制的研究進(jìn)展
    千年古方三拗湯,止咳、化痰、平喘
    地龍生姜平喘
    特別健康(2018年9期)2018-07-17 15:29:08
    亚洲av在线观看美女高潮| 日本午夜av视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲四区av| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产黄片美女视频| 日本wwww免费看| 嫩草影院新地址| 三级毛片av免费| 亚洲av成人精品一区久久| 大香蕉久久网| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产成人aa在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 三级经典国产精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本免费a在线| 一级黄片播放器| 成人一区二区视频在线观看| 国产永久视频网站| 激情五月婷婷亚洲| 三级毛片av免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久国产一区二区| 午夜免费激情av| 欧美高清性xxxxhd video| 国产探花极品一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费黄色在线免费观看| 91狼人影院| 神马国产精品三级电影在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日韩在线观看h| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜视频国产福利| 久久99精品国语久久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 色视频www国产| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久国产a免费观看| 国产片特级美女逼逼视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 九九在线视频观看精品| 少妇的逼好多水| 亚洲国产色片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲成人一二三区av| 99re6热这里在线精品视频| 久久99蜜桃精品久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧美日韩无卡精品| 69人妻影院| 99久国产av精品| 亚洲最大成人中文| 亚洲欧洲国产日韩| 禁无遮挡网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品视频女| 日韩强制内射视频| 午夜福利成人在线免费观看| 成年版毛片免费区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产69精品久久久久777片| 日韩成人伦理影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产极品天堂在线| 国产av国产精品国产| 亚洲av不卡在线观看| 国产成人精品福利久久| 一级毛片 在线播放| 大香蕉97超碰在线| 久久久欧美国产精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 最近中文字幕高清免费大全6| 久久草成人影院| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲av成人精品一二三区| videossex国产| 乱码一卡2卡4卡精品| av.在线天堂| 欧美精品国产亚洲| 久久精品久久久久久久性| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产 亚洲一区二区三区 | 午夜老司机福利剧场| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久精品久久久久久久性| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩伦理黄色片| 亚洲高清免费不卡视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 插逼视频在线观看| 欧美精品国产亚洲| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费大片黄手机在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 老司机影院成人| a级一级毛片免费在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 视频中文字幕在线观看| 在线观看人妻少妇| 免费看a级黄色片| 久久99热这里只频精品6学生| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 中文字幕免费在线视频6| 国产高清不卡午夜福利| 国国产精品蜜臀av免费| 国产91av在线免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲av不卡在线观看| 大陆偷拍与自拍| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美成人精品欧美一级黄| 波野结衣二区三区在线| 欧美精品国产亚洲| 18禁动态无遮挡网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产欧美日韩精品一区二区| eeuss影院久久| 性色avwww在线观看| 联通29元200g的流量卡| 精华霜和精华液先用哪个| 嫩草影院入口| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 只有这里有精品99| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩视频在线欧美| 少妇丰满av| 亚洲最大成人手机在线| 日韩国内少妇激情av| 99热网站在线观看| 人妻系列 视频| 伦理电影大哥的女人| 久久久久久久久大av| 成年人午夜在线观看视频 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产人妻一区二区三区在| 国产成人一区二区在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人aa在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲不卡免费看| 三级国产精品欧美在线观看| 两个人视频免费观看高清| 丝袜喷水一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 禁无遮挡网站| 久久久久国产网址| 麻豆国产97在线/欧美| 成人鲁丝片一二三区免费| 色网站视频免费| 国产精品三级大全| 尤物成人国产欧美一区二区三区| av网站免费在线观看视频 | 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲熟女精品中文字幕| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲av.av天堂| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久综合国产亚洲精品| 国产高清三级在线| 黄片wwwwww| 午夜精品在线福利| 国产毛片a区久久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一级黄片播放器| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 观看免费一级毛片| 久久久午夜欧美精品| 六月丁香七月| 看黄色毛片网站| 久久久久精品久久久久真实原创| 51国产日韩欧美| 大香蕉久久网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产在视频线在精品| 亚洲av国产av综合av卡| 国内精品宾馆在线| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产欧美人成| 观看免费一级毛片| 日韩精品有码人妻一区| 三级国产精品片| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产亚洲最大av| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产成人freesex在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品久久久久久久性| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 激情 狠狠 欧美| 日韩欧美国产在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 午夜精品在线福利| 老司机影院毛片| 听说在线观看完整版免费高清| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av中文av极速乱| videossex国产| 亚洲欧美成人精品一区二区| xxx大片免费视频| 99久国产av精品| 91久久精品电影网| 免费观看无遮挡的男女| 欧美日本视频| 精品久久国产蜜桃| 成人美女网站在线观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 人妻系列 视频| 亚洲电影在线观看av| 久久99热这里只频精品6学生| 联通29元200g的流量卡| 在线免费观看的www视频| 成人欧美大片| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲精品一二三| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国内精品美女久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产免费又黄又爽又色| 色综合亚洲欧美另类图片| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 最近中文字幕高清免费大全6| 秋霞伦理黄片| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品夜色国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜精品一区二区三区免费看| 国产一区二区在线观看日韩| 久久精品久久久久久久性| 永久免费av网站大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久鲁丝午夜福利片| 久久精品综合一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美成人a在线观看| 亚洲性久久影院| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲av成人精品一区久久| 国产不卡一卡二| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成年人午夜在线观看视频 | 免费观看性生交大片5| 欧美潮喷喷水| 国产av不卡久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 深夜a级毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产不卡一卡二| 日本黄色片子视频| 久久热精品热| 国产精品一区www在线观看| av福利片在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲性久久影院| 色综合站精品国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品一区蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件| 免费看日本二区| 国产精品国产三级专区第一集| 老司机影院成人| 精品国产露脸久久av麻豆 | 麻豆成人av视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av免费在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产三级在线视频| 久久99热6这里只有精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 久99久视频精品免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲成人av在线免费| 日韩av在线大香蕉| 白带黄色成豆腐渣| 六月丁香七月| 成人亚洲欧美一区二区av| 色播亚洲综合网| 不卡视频在线观看欧美| 精品一区在线观看国产| 中文字幕免费在线视频6| 22中文网久久字幕| 床上黄色一级片| 午夜激情欧美在线| 国产一区二区三区综合在线观看 | 最后的刺客免费高清国语| 联通29元200g的流量卡| 26uuu在线亚洲综合色| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人精品一,二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 男人狂女人下面高潮的视频| 91av网一区二区| 国产视频内射| 日本与韩国留学比较| 在线免费观看不下载黄p国产| 一区二区三区高清视频在线| 精品人妻熟女av久视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 三级国产精品片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 全区人妻精品视频| 男插女下体视频免费在线播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色播亚洲综合网| 99久久九九国产精品国产免费| 国产黄片视频在线免费观看| 日本熟妇午夜| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人一区二区在线| 免费观看性生交大片5| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品女同一区二区软件| 日韩国内少妇激情av| 嫩草影院新地址| 天天一区二区日本电影三级| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产探花极品一区二区| 在线观看免费高清a一片| av在线亚洲专区| 偷拍熟女少妇极品色| 国产午夜精品论理片| 久久久精品欧美日韩精品| 免费看不卡的av| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲在线自拍视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 听说在线观看完整版免费高清| 中文资源天堂在线| 免费观看性生交大片5| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲国产精品专区欧美| 一级爰片在线观看| 日韩av免费高清视频| 成人欧美大片| 国产精品精品国产色婷婷| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲色图av天堂| 午夜福利在线观看吧| av天堂中文字幕网| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产成人精品久久久久久| 成年人午夜在线观看视频 | 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| ponron亚洲| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美精品专区久久| 精品久久久久久成人av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 成人欧美大片| 一边亲一边摸免费视频| 可以在线观看毛片的网站| 夫妻午夜视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 大香蕉久久网| 春色校园在线视频观看| 久久久久久九九精品二区国产| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩欧美精品v在线| 18禁动态无遮挡网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品久久久久久久久久久久久| 美女黄网站色视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久久午夜电影| 精品少妇黑人巨大在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人毛片a级毛片在线播放| 一级黄片播放器| 亚洲熟女精品中文字幕| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 人人妻人人看人人澡| 一个人免费在线观看电影| 大片免费播放器 马上看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品一及| av专区在线播放| 最近视频中文字幕2019在线8| 特级一级黄色大片| 午夜福利在线观看吧| 国内精品美女久久久久久| 51国产日韩欧美| 精品人妻视频免费看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色吧在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 综合色丁香网| .国产精品久久| 日本欧美国产在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 久热久热在线精品观看| 日日撸夜夜添| av专区在线播放| 亚洲av一区综合| 国产精品一区二区在线观看99 | 波野结衣二区三区在线| 国产淫片久久久久久久久| 久久99精品国语久久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲av成人av| 人妻一区二区av| 69av精品久久久久久| 国产av码专区亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品色激情综合| a级一级毛片免费在线观看| 日本免费a在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久久精品性色| 免费观看a级毛片全部| 亚洲天堂国产精品一区在线| 97在线视频观看| 日本熟妇午夜| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产黄色免费在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲在线自拍视频| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲成人av在线免费| 精品人妻熟女av久视频| 日韩伦理黄色片| 国产色婷婷99| 日韩成人av中文字幕在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费观看a级毛片全部| 真实男女啪啪啪动态图| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲成人av在线免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美bdsm另类| 午夜精品一区二区三区免费看| 18禁在线播放成人免费| 欧美日韩综合久久久久久| 最近的中文字幕免费完整| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产免费又黄又爽又色| 嫩草影院新地址| 免费观看av网站的网址| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久伊人网av| 中文字幕av在线有码专区| 午夜福利视频精品| 国产乱人视频| 亚洲图色成人| 成人特级av手机在线观看| 国产精品.久久久| 精品一区二区三区视频在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩电影二区| 日韩av在线大香蕉| 在线观看av片永久免费下载| 欧美成人午夜免费资源| 一级毛片电影观看| 欧美最新免费一区二区三区| 久久精品夜色国产| 亚洲伊人久久精品综合| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲高清免费不卡视频| 国产黄色免费在线视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一级片'在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲国产最新在线播放| 午夜福利在线在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩综合久久久久久| 少妇熟女欧美另类| www.色视频.com| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 日本与韩国留学比较| 国产高清三级在线| 国产黄片视频在线免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品国产av蜜桃| 夫妻午夜视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品酒店卫生间| 亚洲成人久久爱视频| 在线观看一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 一区二区三区免费毛片| 国产黄频视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲精品国产成人久久av| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久精品国产自在天天线| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费看a级黄色片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲av不卡在线观看| 97在线视频观看| 最近中文字幕2019免费版| 欧美3d第一页| 九色成人免费人妻av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 欧美精品一区二区大全| 九九爱精品视频在线观看| 嫩草影院精品99| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久精品94久久精品| 熟女电影av网| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产欧美人成| 国产老妇女一区| 亚洲精品456在线播放app| 午夜激情久久久久久久| 女人久久www免费人成看片| 韩国av在线不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产成人精品福利久久| 韩国av在线不卡| 亚洲18禁久久av| 成人亚洲精品一区在线观看 | 一个人免费在线观看电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 只有这里有精品99| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人综合一区亚洲| 六月丁香七月| 日韩欧美精品v在线| 午夜免费观看性视频| 插阴视频在线观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| kizo精华| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲性久久影院| 水蜜桃什么品种好| 日韩大片免费观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩一区二区三区影片| 高清av免费在线|