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    平喘顆粒對氣道上皮細(xì)胞自噬及凋亡的抑制作用探討?

    2020-12-06 12:10:32蔣鵬娜王麗潔李竹英
    中國中醫(yī)急癥 2020年11期
    關(guān)鍵詞:雷帕氯喹平喘

    蔣鵬娜 王麗潔 李 星 李竹英

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

    支氣管哮喘是由包括氣道炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)在內(nèi)的多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。哮喘的病理生理狀態(tài)研究較多的主要有:氣道重塑、氣道炎癥、黏液蛋白過度分泌和氧化應(yīng)激過度[2]。近些年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病中作用機(jī)制的不斷被挖掘,許多學(xué)者證實(shí)了自噬主要通過調(diào)節(jié)基因[3]、氧化應(yīng)激、T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)[4]、病毒侵襲[5]等多方面影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者通過觀察平喘顆粒含藥血清對氣道上皮細(xì)胞自噬及凋亡的影響,以探討該藥的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康清潔級(jí)Wistar大鼠,48只雌雄各半,購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心,許可證號(hào):SYXK(黑)2015-003,體質(zhì)量(200±20)g,雌雄分籠飼養(yǎng),自由飲食,在室溫(22±2)℃、濕度(50±10)%條件下適應(yīng)性喂養(yǎng),觀察大鼠在進(jìn)食、飲水、二便、活動(dòng)方面均無異常,1周后正式進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥物與試劑

    平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母共9味藥物組成,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備,規(guī)格10 g/袋,批號(hào)20150102;人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE),購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫(CBP60550);胎牛血清(FBS)來自Sigma公司,雷帕霉素來自上海源葉生物公司,氯喹來自Sigma公司。

    1.3 含藥血清的制備

    取健康清潔級(jí)Wistar大鼠,平喘顆粒連續(xù)給藥3 d(將平喘顆粒稀釋至0.54 g/mL,每次按1 mL/100 g灌胃),末次給藥前禁食12 h,給藥2 h后麻醉,腹主動(dòng)脈取血,采血后靜置30 min,常規(guī)分離血清,56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min,過濾器過濾,密封,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Mㄟ^實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)含藥(平喘顆粒)血清濃度為20%時(shí)[9],對雷帕霉素誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞有較明顯的抑制作用,故實(shí)驗(yàn)中選用該濃度。

    1.4 細(xì)胞分組、加藥及收集

    取對數(shù)生長期的16HBE貼壁細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,將細(xì)胞按照常規(guī)方法接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下細(xì)胞密集度達(dá)到70%時(shí),將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)基細(xì)胞組(正常對照組)、雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組。將雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組分別加入雷帕霉素800 μL,對照組加入等量的DMEM不完全培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12 h后棄去各組培養(yǎng)基,重新將正常對照組、雷帕霉素組分別加入800 μL DMEM不完全培養(yǎng)液,雷帕霉素加氯喹組加入800 μL氯喹溶液,雷帕霉素加中藥組加入800 μL含中藥血清,再次放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h。棄去各組培養(yǎng)液,常規(guī)消化細(xì)胞,分別刮取收集各組細(xì)胞,保存至1.5 mL離心管內(nèi)。

    1.5 電鏡下觀察細(xì)胞自噬

    棄去培養(yǎng)液,常規(guī)消化細(xì)胞,刮取細(xì)胞,分別收集各組細(xì)胞,用戊二醛固定后,按照電鏡操作流程處理細(xì)胞后觀察各組細(xì)胞自噬情況。

    1.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況

    收集培養(yǎng)的細(xì)胞,調(diào)成密度為5×105個(gè)/mL,按照操作流程進(jìn)行流式細(xì)胞檢測,Anneexin V-FITC為綠色熒光,碘化丙啶(PI)為紅色熒光,在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,正常的活細(xì)胞不被Anneexin V-FITC和PI染色;凋亡早期的細(xì)胞僅被Anneexin V-FITC染色,PI染色呈陰性;壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞可以同時(shí)被Anneexin V-FITC和PI染色。散點(diǎn)圖的左上象限是可允許范圍內(nèi)的檢測誤差。

    1.7 Westen blotting方法檢測細(xì)胞中自噬效應(yīng)蛋白-1(Beclin-1)、Caspase-3蛋白表達(dá)

    將準(zhǔn)備就緒的各組細(xì)胞按照BCA蛋白濃度檢測說明書進(jìn)行測定,利用酶標(biāo)儀讀取OD值,在蛋白定量后用還原樣品加熱,使蛋白變性,電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膠片曝光、定影等過程同膠片掃描后分析結(jié)果。檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)基因蛋白Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)水平,并對其條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示,組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 電鏡檢測結(jié)果

    2.1.1 雷帕霉素誘導(dǎo)12 h 16HBE觀察 見圖1。正常對照組中細(xì)胞核染色質(zhì)豐富且均勻,可清晰見到線粒體及完整峭結(jié)構(gòu),細(xì)胞整體形態(tài)良好;經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作用后,其余3組中部分細(xì)胞內(nèi)可見單層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡,內(nèi)含細(xì)胞器腫脹變形,部分線粒體空泡化,峭開始溶解。

    圖1 各組12 h 16HBE電鏡結(jié)構(gòu)圖(25 000倍)

    2.1.2 雷帕霉素誘導(dǎo)后加藥物干預(yù)電鏡觀察 見圖2。正常對照組中細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)及形態(tài)完好,細(xì)胞核染色質(zhì)豐富、分布均勻,胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體,峭較完整;加氯喹干預(yù)后24 h,細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,可見自噬泡,少量線粒體出現(xiàn)峭溶解斷裂;加中藥血清干預(yù)后24 h,細(xì)胞基本形態(tài)較好,可見到自噬泡和線粒體,其中線粒體峭較完整。由圖可見,經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)改變了正常基本結(jié)構(gòu),出現(xiàn)了線粒體腫脹,甚至溶解、空泡化。而分別在氯喹和含藥血清干預(yù)已自噬的細(xì)胞后,其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)均明顯改善,細(xì)胞活力增加,說明由雷帕霉素引起的自噬在氯喹或者中藥平喘顆粒的干預(yù)下可以得到抑制或者改善,從而對細(xì)胞起到保護(hù)作用。

    圖2 各組細(xì)胞電鏡結(jié)構(gòu)圖(25 000倍)

    2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

    見表1,圖3。經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后,16HBE細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均增加(P<0.05)。而經(jīng)氯喹阻斷后,細(xì)胞晚期凋亡率明顯下降(P<0.05),而早期凋亡率下降不明顯(P>0.05),總凋亡率也呈下降趨勢(P<0.05)。經(jīng)平喘顆粒干預(yù)后,細(xì)胞早期凋亡率變化也不明顯(P>0.05),晚期凋亡率明顯下降(P<0.05),總凋亡率也呈下降趨勢(P<0.05)。

    表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    表1 各組細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    與正常對照組比較,?P< 0.05,??P< 0.01;與雷帕霉素組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同

    組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6早期凋亡率6.135±0.422 10.125±0.635**14.581±1.232**10.056±1.114**晚期凋亡率9.123±0.307 26.843±2.136**12.426±1.667**△△17.011±1.606**△△總凋亡率16.012±0.823 35.266±2.736**26.758±2.697**△△26.903±2.792**△△

    圖3 各組細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果

    2.3 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

    見表2,圖4。結(jié)果顯示,雷帕霉素組和雷帕加氯喹組Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.05或P<0.01),其中雷帕霉素組上述指標(biāo)的表達(dá)較雷帕加中藥組增高(P<0.05)。在雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡中,自噬和凋亡二者相互促進(jìn),Caspase-3蛋白表達(dá)增加,而氯喹和中藥平喘顆粒組Caspase-3蛋白表達(dá)受抑制。

    表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(±s)

    表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(±s)

    組別正常對照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6 Beclin-1 GAPDH 0.61±0.33 0.82±0.37**0.71±0.29*△△0.43±0.30**△△Caspase-3 GAPDH 0.46±0.27 0.97±0.30**0.55±0.22*△△0.54±0.25*△△

    圖4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

    3 討論

    劉建秋教授根據(jù)多年治療哮喘慢性持續(xù)期或者緩解期的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出了“見痰不治痰,重用溫藥,既化飲又給邪以出路,補(bǔ)中有消,溫中有行,開中有闔”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑,由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子等9味藥物組成。前期臨床研究表明平喘顆粒用于慢性持續(xù)期的陽虛痰盛證哮喘患者治療效果尤佳,亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病[6-7]。在前期平喘顆粒藥效學(xué)研究中該藥物可促進(jìn)小鼠氣管酚紅的排泄量和促進(jìn)呼吸道上皮纖毛運(yùn)動(dòng),促使痰液稀釋并發(fā)揮排痰的作用[8]。也有研究表明哮喘發(fā)病時(shí)引起氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而結(jié)局則是以細(xì)胞重回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞自噬或細(xì)胞凋亡等形式結(jié)束[9]。氣管上皮細(xì)胞的新陳代謝中自噬與凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式,自噬可以促進(jìn)凋亡發(fā)生,又可以通過提供營養(yǎng)和能力發(fā)揮防御作用,抑制凋亡或者延遲凋亡,而在調(diào)控方面,二者又可獨(dú)立發(fā)揮作用,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。Beclin-1作為自噬的直接執(zhí)行者,不僅可促進(jìn)自噬吞噬體形成[11],增加自噬發(fā)生[12],同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡[13]。劉娟等提出在哮喘患者中Beclin-1可能同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡和自噬的過程,調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),緩解哮喘的急性發(fā)作與慢性病程[14]。Caspases又稱凋亡蛋白酶,Caspase-3處于兩條凋亡信號(hào)通路的中心位置,通過介導(dǎo)特異性肽鍵,引起凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15-16],執(zhí)行細(xì)胞最終凋亡過程[17]。國內(nèi)研究表明在嬰幼兒喘息性疾病的研究中[18],嗜酸性粒細(xì)胞中的凋亡因子Caspase-3活性降低,抗凋亡Bcl-2基因表達(dá)增多,在兩者共同作用下導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞凋亡減緩,使得患兒外周血中嗜酸性粒細(xì)胞相對增多。

    本實(shí)驗(yàn)用雷帕霉素[19]誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞自噬,通過電鏡發(fā)現(xiàn)自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)-自噬泡的存在,還觀察到凋亡細(xì)胞,并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況,其結(jié)果均明顯出現(xiàn)自噬和凋亡指征,凋亡率明顯增加,自噬泡及溶酶體增多,凋亡標(biāo)志蛋白酶Caspase-3/Beclin-1表達(dá)均顯著增加,而應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和中藥平喘顆粒后,凋亡率、自噬數(shù)量、Caspase-3、抑凋亡蛋白Beclin-1表達(dá)均明顯下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素激活氣道上皮細(xì)胞自噬途徑后,平喘顆粒有類氯喹作用,在哮喘發(fā)病的自噬過程中對病變細(xì)胞的凋亡與自噬起抑制作用,且此過程中凋亡與自噬二者呈正相關(guān)。

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