生氰糖苷脫毒菌株篩選及其發(fā)酵亞麻籽餅研究

郭寶珠 蔡輝益 王茂森 逯春香 劉國華 常文環(huán) 鄭愛娟 陳志敏

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所 生物飼料開發(fā)國家工程研究中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點實驗室，北京100081；2.張家口市畜牧技術(shù)推廣站，河北張家口075000）

亞麻（亦稱胡麻）是一種在溫帶地區(qū)廣泛種植的油料作物[1]。亞麻籽餅粕為亞麻籽榨油后的副產(chǎn)物，其粗蛋白質(zhì)含量為32.2%～34.8%，可作為蛋白質(zhì)飼料原料[2]。此外，亞麻籽餅粕富含多種生物功能活性成分，如α-亞麻酸、木酚素等[3]，具有較高的飼用潛能。但是，亞麻籽餅粕存在抗營養(yǎng)物質(zhì)[4]，如CGs、亞麻籽膠、抗維生素B6因子等,其中CGs 極大地限制了亞麻籽餅粕在動物飼糧中應(yīng)用[5]。前人對CGs脫毒做了大量研究，脫除亞麻籽餅粕中CGs 的傳統(tǒng)方法有水煮法、溶劑法、擠壓法、烘烤法等，近年來又出現(xiàn)了微波法和酶法，而這些方法都存在不同程度的缺陷，難以在生產(chǎn)實際中應(yīng)用[6]。隨著微生物發(fā)酵飼料的逐漸興起，人們發(fā)現(xiàn)了微生物在脫除飼料原料抗營養(yǎng)因子中的優(yōu)勢，微生物不僅能降解抗營養(yǎng)因子，還能提高飼料原料的營養(yǎng)價值[7]，而且微生物發(fā)酵具有成本低、營養(yǎng)物質(zhì)損失小等優(yōu)點[8]。微生物發(fā)酵在亞麻籽餅粕脫毒研究方面也得到了應(yīng)用，但是先前對發(fā)酵亞麻籽餅粕的研究[6，9-10]還有許多方面需要改進，第一，先前研究中所用天然菌株類別單一多為酵母菌、曲霉菌等真菌類菌株且對CGs 脫毒率較低；第二，工程改造菌雖然對亞麻籽的脫毒率高但又非農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許添加在飼料中的微生物，其安全性得不到保障；第三，先前研究關(guān)注CGs 脫除較多而對亞麻籽餅粕中其他營養(yǎng)成分變化關(guān)注較少。因此，試驗旨在篩選出CGs脫毒率高同時又能改善亞麻籽餅營養(yǎng)組成的安全菌株，并通過發(fā)酵試驗探究其發(fā)酵處理亞麻籽餅的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 亞麻籽餅：購自呼和浩特市蒙谷香生物科技有限公司。

1.1.2 瘤胃液：采自中國農(nóng)業(yè)科學院南口中試基地“杜泊羊×小尾寒羊”的二元雜交綿羊，該綿羊裝有永久瘤胃瘺管并飼喂正常飼草，瘤胃液保存于4 ℃冰箱中。

1.1.3 好氧發(fā)酵袋：由中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所單胃動物飼料創(chuàng)新團隊提供。

1.1.4 培養(yǎng)基

①細菌篩選固體培養(yǎng)基（七葉苷-LB 固體培養(yǎng)基）：酵母提取物0.5 g、瓊脂粉1.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、七葉苷0.05 g、檸檬酸鐵0.01 g、蒸餾水100 ml，121 ℃滅菌20 min。

②細菌基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基（LB 固體培養(yǎng)基）：酵母提取物0.5 g、瓊脂粉1.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、蒸餾水100 ml，121 ℃滅菌20 min。

③細菌基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（LB 液體培養(yǎng)基）：酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、蒸餾水100 ml，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 CGs降解菌的初篩

采用七葉苷檸檬酸鐵板法[11-12]進行菌株的初篩，具體步驟如下：

用4層無菌紗布將綿羊瘤胃液過濾，吸取1 ml濾液用無菌水分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4倍，分別吸取不同稀釋倍數(shù)的濾液20 μl涂布于LB固體平板上，每個倍數(shù)的稀釋液涂布2個LB固體平板，其中1個平板置于厭氧袋中，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，待長出菌落后, 挑取出現(xiàn)變色圈的菌落進行劃線、分離，按照上述方法反復劃線、分離，直至出現(xiàn)單一菌落。將出現(xiàn)變色圈的菌株純化后，分別接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后,吸取10 μl培養(yǎng)液滴于篩選平板的中央，每株菌做三個重復，在培養(yǎng)48 h后用刻度尺分別測量變色圈直徑（d1）和菌落直徑（d2）的大小，以d1/d2的結(jié)果為指標，選取比值較大的菌株作為初篩菌株并保藏[13]。

1.2.2 CGs降解菌的復篩

將初篩的4株菌擴大培養(yǎng)后，分別取3 ml菌液于300 ml 燒杯中，加入21 ml 的無菌蒸餾水，混勻，加入30 g 亞麻籽餅粉，攪拌均勻，封瓶口膜封口，置于37 ℃培養(yǎng)箱中72 h，每個處理設(shè)3個重復。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵料自然風干。測定各試驗樣品CGs 含量，選取CGs降解效果最佳株菌進行鑒定。

1.2.3 菌株鑒定

觀察菌株菌落形態(tài)并參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對篩選的菌株進行初步鑒定，菌株培養(yǎng)48 h 后觀察單菌落的顏色、形狀、大小、粗糙程度、邊緣等。并將菌株委托于北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司進行菌株16S rDNA測定。

1.2.4 菌株生長曲線測定

挑取枯草芽孢桿菌單菌落一環(huán)于10 ml 液體LB培養(yǎng)基中并置于37 ℃恒溫搖床，24 h 后取上述培養(yǎng)液1 ml于100 ml液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)36 h，每2 h取樣1次，于紫外分光光度計600 nm處測定OD值,最后繪制OD值隨時間變化曲線圖。

1.2.5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理亞麻籽餅

取1 kg 亞麻籽餅作為唯一發(fā)酵底物于好氧發(fā)酵袋進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌發(fā)酵，發(fā)酵條件為：時間72 h、溫度39 ℃、料水比1:0.7、接種量4%。未處理組為亞麻籽餅原料不進行任何處理。每個處理三個重復，處理后的樣品經(jīng)自然風干后測定CGs 含量并計算CGs 的脫毒率，同時測定干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、多肽、粗纖維和粗脂肪含量。

CGs 脫毒率（%）=（未處理組CGs 含量-發(fā)酵后CGs含量）/未處理組CGs含量×100

1.3 測定指標及方法

參考GB/T 13084—2006的比色法測定CGs含量，稱取10 g（精確到0.001 g）樣品于500 ml 水蒸氣蒸餾裝置中,加水約200 ml，塞嚴瓶口，在室溫放置4 h，加入20 ml乙酸鋅溶液和2.0 g酒石酸，迅速連接好蒸餾裝置,將冷凝管下端插入盛有10 ml 20 g/l氫氧化鈉溶液的100 ml錐形瓶液面下。進行水蒸氣蒸餾,收集蒸餾液約100 ml 時，取下錐形瓶，將錐形瓶收集的蒸餾液完全轉(zhuǎn)移至250 ml 容量瓶中，用水定容至刻度線。量取10 ml容量瓶溶液置于25 ml比色管中，作為試樣溶液。試樣溶液中加1 ml 10 g/l氫氧化鈉溶液和1滴酚酞指示液，用乙酸溶液緩慢調(diào)至紅色褪去，加5 ml磷酸鹽緩溶液，37 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，分別加入0.25 ml 氯胺T 溶液，加塞振蕩混合均勻，放置5 min。分別加入5 ml 異煙酸-吡唑酮溶液,加水至25 ml，混勻。37 ℃恒溫水浴鍋中放置40 min，用2 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長638 nm處測吸光度。

采用杜馬斯全自動定氮儀測定粗蛋白質(zhì)含量；采用濾袋法測定粗纖維含量；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量；參照GB/T 22492—2008大豆肽粉的測定方法測定多肽含量；干物質(zhì)(dry matter，DM）含量的測定方法參照GB/T 6435—2014,采用鼓風干燥箱測定。以上所有測定指標結(jié)果均以絕干質(zhì)量為基礎(chǔ)表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的one-way ANO?VA 過程進行方差檢驗，Duncan's 法進行各組間平均值的多重比較，以P<0.05 作為差異顯著性判斷標準。試驗結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 菌株初篩與復篩

初篩結(jié)果如表1所示，從綿羊瘤胃液中分離得到9株出現(xiàn)黑色圈的菌株，其中有4 株菌（L1、L2、L3、L4）d1/d2的結(jié)果大于等于1.5。復篩結(jié)果如表2 所示，菌株L4的脫毒效果顯著高于其他菌株（P<0.05）。

表1 9株目的菌培養(yǎng)48 h變色圈直徑與菌落直徑比值

表2 4株初篩菌發(fā)酵處理亞麻籽餅脫毒效果

2.2 菌株鑒定

將復篩的菌株L4在LB 平板上培養(yǎng)48 h，觀察到菌株L4 形成圓形菌落，邊緣不規(guī)則，表面干燥粗糙。在顯微鏡下觀察到菌株L4 的菌體均為桿狀，革蘭氏染色為陽性。16S rDNA 菌株鑒定結(jié)果表明：菌株L4屬于芽孢桿菌屬，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1 同源性達100%，CGMCC 登記號為18229，由此確定L4 為枯草芽孢桿菌，且枯草芽孢桿菌屬于飼料添加劑品種目錄中允許使用的菌株[15]，最終選用L4枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株。

2.3 菌株生長曲線

如圖1所示，枯草芽孢桿菌經(jīng)過短暫的生長緩慢期，在2 h 到24 h 處于生長對數(shù)期，在24 h 達到最大生長濃度，然后進入平臺期。因此，在后續(xù)發(fā)酵試驗中應(yīng)選取培養(yǎng)24 h的菌液作為發(fā)酵種子液。

圖1 枯草芽孢桿菌的生長曲線

2.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理亞麻籽餅對營養(yǎng)組成的影響

由表3 可知，枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs 脫毒率超過90%，亞麻籽餅營養(yǎng)組成得到改善。粗蛋白質(zhì)含量由(36.79±0.37)%顯著提高到(39.43±0.53)%（P<0.05），多肽含量由(1.65±0.06)%顯著提高到(4.41±0.03)%（P<0.05），粗脂肪含量由(8.81±0.09)%顯著提高到(9.55±0.07)%（P<0.05），粗纖維含量變化不顯著（P>0.05）。

表3 發(fā)酵處理亞麻籽餅對營養(yǎng)組成的影響

3 討論

3.1 CGs脫毒菌株的篩選及其脫毒機理

據(jù)報道[16-18]，已從反芻動物瘤胃中篩選出多種需氧型芽孢桿菌，如浸麻芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。本研究篩選的CGs脫毒菌株為枯草芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬為需氧菌，反芻動物瘤胃內(nèi)容物含氧量很少[19]，需氧型的芽孢桿菌不能長期在瘤胃中生存繁殖，因此推測瘤胃中這些需氧型芽孢桿菌可能隨飼草等進入反芻動物瘤胃并暫時存留。亞麻籽中CGs 主要為β-龍膽二糖丙酮氰醇（linustatin，LN）和β-龍膽二糖甲乙酮氰醇（neolinustatin,NN）[20]，LN 和NN 均可被β-葡萄糖苷酶水解為氰醇和葡萄糖，氰醇在中性和堿性環(huán)境中非常不穩(wěn)定能夠自發(fā)分解（羥腈裂解酶可加速這一過程）產(chǎn)生酮化合物和HCN[21-22]。研究初篩結(jié)果表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強，復篩結(jié)果表明該株枯草芽孢桿菌能以亞麻籽餅為唯一底物生長，因此在枯草芽孢桿菌分泌的各種酶作用下，亞麻籽餅的結(jié)構(gòu)被破壞，CGs 與β-葡萄糖苷酶充分接觸而發(fā)生分解，產(chǎn)生的HCN 易揮發(fā)，從而達到亞麻籽餅脫毒。

3.2 不同發(fā)酵菌株降解亞麻籽餅CGs能力比較

微生物發(fā)酵處理亞麻籽餅降解生氰糖苷的研究報道較少，發(fā)酵菌株不同降解生氰糖苷能力也不同，梅鶯等[6]研究表明枯草芽孢桿菌(Bacillus sublitis)ACCC01183 發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs 脫毒率為73.28%，本研究篩選出的枯草芽孢桿菌（Bacillus sub?tilis strain）KY652941.1 發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs 脫毒率超過90%；Li 等[23]研究表明菌株Lichtheimia ramose發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs 脫毒率為89%；翟雙雙[9]研究表明產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）GIM 2.148 和黑曲霉（Aspergillus niger）GIM 3.576 混合發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs脫毒率為75.94%；馮愛娟等[10]用重組畢赤酵母（GS115-Ch-Glu）發(fā)酵處理亞麻籽CGs 脫毒率達97.00%。綜上所述，與其他發(fā)酵菌株相比，本研究篩選出的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs脫毒率較高，是目前已知CGs脫毒率最高的天然菌株。

3.3 發(fā)酵處理改善亞麻籽餅營養(yǎng)組成的機理

研究表明[10-11，24-25]，經(jīng)微生物發(fā)酵處理，可顯著提高亞麻籽餅粕、菜籽餅粕、棉粕等雜粕的粗蛋白質(zhì)含量，這是由于發(fā)酵過程中碳水化合物等底物的消耗使得粗蛋白質(zhì)在發(fā)酵料中百分含量增加。同時在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌分泌的蛋白酶可將亞麻籽餅中部分大分子蛋白質(zhì)分解為易被動物消化吸收的多肽。本研究中所用的枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，而該酶又是纖維素酶系的重要組成成分在纖維素降解方面有著重要的作用，可以把纖維二糖水解成葡萄糖[26-27]因此該株枯草芽孢桿菌可能對粗纖維具有一定的降解能力，發(fā)酵亞麻籽餅的過程中部分粗纖維被降解，但是底物的消耗并未使粗纖維的百分含量在發(fā)酵料中增加。亞麻籽餅經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理后，降低了抗營養(yǎng)因子-CGs含量，顯著提高了粗蛋白質(zhì)、多肽等的含量，提高了其營養(yǎng)價值。研究表明[28-29]，亞麻籽餅粕在反芻動物日糧中最高添加量為20%，在豬日糧中適宜添加量為8%～10%，日糧中添加5%亞麻籽餅顯著降低肉雞生長性能，本研究發(fā)酵處理能提高亞麻籽餅營養(yǎng)價值，但能否提高其在動物飼糧中的添加量還需進一步研究。

4 結(jié)論

①本研究篩選出一株高效降解CGs 的天然菌株，經(jīng)鑒定此菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1。

②所篩選枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理亞麻籽餅CGs脫毒率超過90%。

③所篩選枯草芽孢桿菌發(fā)酵處理亞麻籽餅改善了其營養(yǎng)組成顯著提高粗蛋白質(zhì)、多肽含量和粗脂肪含量，極大地提高了亞麻籽餅的營養(yǎng)價值。