響應(yīng)面優(yōu)化略陽黃精組培快繁技術(shù)

趙 欣1， 豆佳媛， 馬存德3， 王 琪1， 彭修娟

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院， 陜西 咸陽 712046；2.陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥研究院， 陜西 咸陽 712046；3.陜西步長制藥有限公司， 西安 710075)

略陽黃精，百合科黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，產(chǎn)于陜西省漢中市略陽縣，2017年被評為中國國家地理標志產(chǎn)品。其根莖呈結(jié)節(jié)狀彎柱形，單節(jié)雞頭狀，肉質(zhì)油潤，色澤黃褐透亮，斷面透明，味甜筋少[1]。含有黃精多糖、皂苷、生物堿、維生素、氨基酸、黃酮及蒽醌類化合物、木脂素及微量元素等多種物質(zhì)，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎、抑制腫瘤細胞、延緩衰老、降血糖血脂、抗病毒、消炎等功效[2-4]。兼具食用、藥用和觀賞價值，也是規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)藥品、保健品的重要原料，具有廣闊的開發(fā)利用前景[5,6]。

黃精的自然繁殖方式有2種：有性繁殖(種子繁殖)和無性繁殖(根莖芽繁殖)，在自然條件下黃精種子發(fā)芽率低，育苗周期長且收集難度大，采用自然繁殖手段生產(chǎn)效率低，無法滿足市場的需求[7]。隨著組培快繁技術(shù)的發(fā)展，建立略陽黃精的組培快繁技術(shù)體系，利用組織培養(yǎng)方式快速育苗，可有效解決種苗供不應(yīng)求的問題[8,9]。黃精組培快繁過程中的關(guān)鍵點就是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是否合適會影響黃精愈傷組織形成、不定芽增殖以及生根率等。吳宇函等[10]報道，在培養(yǎng)基中添加6-芐基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)等激素，可以顯著提高增殖率和生根率。常用的激素主要有細胞分裂素和生長素兩大類，其中細胞分裂素影響細胞的分裂、生長和分化，而生長素誘導(dǎo)刺激細胞分裂和根的分化，二者以不同濃度的配合使用，可以達到誘導(dǎo)分生苗增殖、促進組培苗生長以及誘導(dǎo)根的形成的目的[11,12]。

關(guān)于略陽黃精的研究僅限于資源調(diào)查方面，組培方面的研究較少[13]。因此，本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，開展略陽黃精組培技術(shù)研究。通過響應(yīng)面法優(yōu)化組培過程中初代培養(yǎng)基、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的配方，篩選出適合略陽黃精組培苗各個階段生長的最適培養(yǎng)基，優(yōu)化略陽黃精的組培快繁技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

略陽黃精根莖芽取自陜西省漢中市略陽縣，4—6月選取當年生、生長健壯、無病蟲害的植株。

1.2 實驗方法

1.2.1外植體預(yù)處理及消毒

預(yù)處理：將外植體用洗潔精(5%，w/w)溶液浸泡30 min，然后用流水沖洗30 min，清洗干凈后，切成1 cm×1 cm的帶芽根莖，加入0.5 g·L-1多菌靈處理12 h。

接種前表皮消毒：將預(yù)處理后的外植體轉(zhuǎn)移至無菌超凈工作臺中并進行如下操作：75%的酒精浸泡30 s→無菌水沖洗3遍→0.2%的HgCl2浸泡6 min→無菌水沖洗3遍→10%的NaClO浸泡5 min→無菌水沖洗3遍→取出用無菌濾紙吸干水分，將與HgCl2接觸的切面部分切掉，接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)[14]。

1.2.2根莖芽的初代培養(yǎng)

將預(yù)處理及消毒后的黃精根莖芽轉(zhuǎn)接到初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉，同時添加不同濃度組合的植物激素6-BA、NAA和TDZ[15]，每個處理接種40個，每瓶接種3個，3次重復(fù)，45 d后觀察并統(tǒng)計萌發(fā)率，采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗篩選出適合黃精根莖芽的最佳初代培養(yǎng)基。

表1 響應(yīng)面組合因素水平

1.2.3不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將萌發(fā)后的健壯根莖芽轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉，同時添加不同濃度組合的植物激素6-BA、NAA和2,4-D[16]，每個處理接種30個，每瓶接種3個，3次重復(fù)，45 d后觀察并統(tǒng)計不定芽的分化數(shù)，采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗篩選出適合黃精不定芽分化的最佳培養(yǎng)基。

表2 響應(yīng)面組合因素水平

1.2.4生根培養(yǎng)

將粗壯無根苗接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為1/2 MS+15 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉，同時添加不同濃度組合的植物激素IBA、NAA和AC[18]，每個處理接種30株，45 d后統(tǒng)計生根率，采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗篩選出略陽黃精最佳生根培養(yǎng)基。

表3 響應(yīng)面組合因素水平

1.2.5培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均調(diào)pH至5.8～6.0，在121 ℃下滅菌20 min。組培室培養(yǎng)溫度除生根暗處理外均是(25±2)℃，光照強度控制在1 600～2 000 lx之間，連續(xù)光照每天16 h，濕度控制在70%左右。

1.3 統(tǒng)計方法

萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)個數(shù)/接種個數(shù))×100%；

不定芽平均個數(shù)=誘導(dǎo)出的所有不定芽數(shù)/接種個數(shù)；

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert(Version 8.0)軟件進行作圖，采用SPSS(Version 17.0)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果

在Version 8.0軟件中以Box-Behnken中心組合原則進行設(shè)計，以6-BA、NAA、TDZ添加量為自變量，黃精萌發(fā)率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果見表4。對表4中實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得回歸模型方程如下：

Y=30.88+2.64a+1.09b+1.05c-1.20ab+0.63ac-0.83bc+3.01a2+1.36b2+2.19c2

2.1.2回歸模型方差分析

方差分析及相關(guān)系數(shù)可以評價模型的可靠性。由表5可知，模型F值為29.78，所得培養(yǎng)基配方萌發(fā)率的回歸方程極顯著(p<0.000 1)；失擬項F值為5.60(p>0.05)，所以該模型可以對初代培養(yǎng)基配方進行準確的預(yù)測和分析。R2=97.45%，說明萌發(fā)率的變化有97.45%來源于6-BA、NAA和TDZ添加量。方差分析結(jié)果顯示：一次項和二次項都有顯著性因素，其中a、b、c、ab、a2、b2、c2顯著，說明3種因素對萌發(fā)率具有顯著影響，對萌發(fā)率的貢獻大小依次為6-BA>NAA>TDZ。可以使用該回歸模型確定最佳初代培養(yǎng)基配方。

表4 Box-Behnken實驗方案及實驗結(jié)果

表5 回歸模型方差分析

2.1.3響應(yīng)面分析

由圖1可知，在NAA添加量較少時，萌發(fā)率隨著

6-BA添加量增加呈升高趨勢，隨著NAA添加量逐漸增加，萌發(fā)率隨6-BA添加量變化趨勢逐漸變緩。在6-BA添加量較低時，其萌發(fā)率隨NAA添加量增加呈升高趨勢，隨著6-BA添加量逐漸增高，其萌發(fā)率變化幅度越來越小。由方差分析可知，兩者對黃精萌發(fā)率影響顯著，與其相對應(yīng)的等高線形狀為橢圓形。結(jié)果表明，6-BA和NAA添加量交互作用顯著。根據(jù)實驗所得回歸方程，得到初代培養(yǎng)基最佳配方為：6-BA添加量1.49 mg·L-1，NAA添加量0.31 mg·L-1，TDZ添加量0.60 mg·L-1，由回歸方程預(yù)測在此條件下萌發(fā)率為40.8%。

圖1 6-BA和NAA添加量對萌發(fā)率的影響

2.2 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果

在Version 8.0軟件中以Box-Behnken中心組合原則進行設(shè)計，以6-BA、NAA、2,4-D添加量為自變量，平均不定芽個數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面實驗，結(jié)果見表6。將表6實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得回歸模型方程為：

Y=3.19+0.35a+0.18b+0.36c+0.023ab-0.17ac+0.028bc+0.48a2-0.12b2-0.19c2

2.2.2回歸模型方差分析

由表7可知，所得模型F值為21.81，平均不定芽個數(shù)的回歸方程極顯著(p<0.0001)；失擬項F值為5.06(p>0.05)，該模型可以對不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方進行準確的預(yù)測和分析。R2=96.56%，說明平均不定芽個數(shù)的變化有96.56%來源于6-BA、NAA和2,4-D添加量。方差分析結(jié)果顯示，一次項和二次項都有顯著性因素，其中a、b、c、ac、a2、c2顯著，3種因素對平均不定芽個數(shù)具有顯著影響，對不定芽誘導(dǎo)的貢獻大小依次為2,4-D>6-BA>NAA?？梢岳庙憫?yīng)面回歸方程確定最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

表6 Box-Behnken實驗方案及實驗結(jié)果

表7 回歸模型方差分析

2.2.3響應(yīng)面分析

由圖2可知，無論6-BA添加量處于何種水平，平均不定芽誘導(dǎo)個數(shù)隨著2,4-D添加量增加呈升高趨勢，無論2,4-D處于何種水平，平均不定芽誘導(dǎo)個數(shù)隨著6-BA添加量增加先保持不變后緩慢增加。由方差分析可知，兩者交互作用對不定芽誘導(dǎo)影響顯著。細胞分裂素6-BA與生長素配合對不定芽分化的促進作用優(yōu)于單獨使用。

圖2 6-BA和2,4-D添加量對不定芽誘導(dǎo)的影響

根據(jù)所得模型方程，得到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配方為：6-BA添加量3.00 mg·L-1，NAA添加量0.49 mg·L-1，2,4-D添加量1.26 mg·L-1，由回歸方程預(yù)測在此條件下平均不定芽個數(shù)為4.14個。在該條件下實際測定平均不定芽個數(shù)達4.02個，因此該模型可以很好的反映不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配比。

2.3 生根培養(yǎng)

2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果

在Version 8.0軟件中以Box-Behnken中心組合原則進行設(shè)計，以IBA、NAA、AC添加量為自變量，生根率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表8。采用軟件對實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得回歸模型方程為：

Y=87.12+2.41a+1.29b+1.33c+0.55ab+0.13ac-0.025bc+1.41a2-1.09b2+0.09c2

表8 Box-Behnken實驗方案及實驗結(jié)果

注：a和b分別代表不定芽誘導(dǎo)階段的對照組和優(yōu)化組，c和d分別代表生根培養(yǎng)階段的對照組和優(yōu)化組。 圖4 略陽黃精組培苗生長趨勢

圖3 IBA和NAA添加量對生根率的影響

2.3.2回歸模型顯著性分析

由表9可知，模型F值為133.97，所得生根培養(yǎng)基配方生根率的回歸方程極顯著(p<0.0001)；失擬項F值為6.40(p>0.05)，該模型可以對生根培養(yǎng)基配方進行準確的預(yù)測和分析。R2=99.42%，說明生根率的變化有99.42%來源于IBA、NAA和AC添加量。方差分析結(jié)果顯示：一次項和二次項都有顯著性因素，其中a、b、c、ab、a2、b2顯著，3種因素對生根率具有顯著影響，對生根率的貢獻大小依次為IBA>AC>NAA?？梢岳没貧w方程確定最佳生根培養(yǎng)基配方。

2.3.3響應(yīng)面分析

由圖3可知，無論NAA添加量處于何種水平，生根率隨著IBA添加量增加呈升高趨勢；在IBA含量較低時，生根率隨NAA添加量增加變化不大，隨著IBA含量逐漸升高，生根率隨NAA添加量增加升高趨勢越來越明顯。由方差分析可知，兩者交互作用對生根率影響顯著。

根據(jù)所得模型方程，得到生根培養(yǎng)基的最佳配方為：IBA添加量0.60 mg·L-1，NAA添加量0.59 mg·L-1，AC添加量0.24 g·L-1，由回歸方程預(yù)測在此條件下萌發(fā)率為92.3%。在該條件下實際測定培養(yǎng)基生根率的平均值達91.5%，因此該模型可以很好的反映生根培養(yǎng)基的最佳配比。

3 討論與結(jié)論

圖4為培養(yǎng)基優(yōu)化前后略陽黃精組培苗生長趨勢，對照圖中a/b和c/d可以明顯看出，優(yōu)化培養(yǎng)基后平均不定芽個數(shù)和生根率明顯升高。優(yōu)化后的初代培養(yǎng)基能夠使黃精萌發(fā)率平均值達39.5%，與直接處理黃精種子并接種到MS培養(yǎng)基中(測定出多花黃精發(fā)芽率僅為27.6%)[18]相比，添加了細胞分裂素和生長素的初代培養(yǎng)基會顯著增加黃精萌發(fā)率。影響組培苗生根的因素有很多，激素種類和濃度、培養(yǎng)基類型、蔗糖濃度、光照、浸蘸濃度以及一些附加物等，其中激素種類和濃度以及培養(yǎng)基類型影響最大[19]。生長素對不定根的形成具有誘導(dǎo)作用，不同種類的生長素誘導(dǎo)效果在不同的植物中表現(xiàn)不同，生長素IBA和NAA對不定根的誘導(dǎo)比較穩(wěn)定，且在多種植物中IBA對不定根的誘導(dǎo)作用效果較好[20]。而培養(yǎng)基中加入活性炭(AC)可使根變得更加粗壯，苗的長勢也更加健壯，陸靜等報道，通過在培養(yǎng)基中添加NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.2 g·L-1，生根率達89%[21]。高濃度無機鹽會使組培苗根少，粗又短，且為黃色，不利于組培苗生根[22]。因此，一般不用完全MS誘導(dǎo)生根，而是將大量元素適當減少，其它如微量、有機等元素保持不變。

表9 回歸模型方差分析

本研究通過比較細胞分裂素(6-BA、IBA、TDZ)和生長素(NAA、2,4-D、AC)不同濃度配比對略陽黃精組培苗不同生長階段的影響，并通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗對培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，得出最適初代培養(yǎng)基為MS+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉+1.49 mg·L-16-BA+0.31 mg·L-1NAA+0.60 mg·L-1TDZ，萌發(fā)率平均值達39.5%；最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+30 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉+3.00 mg·L-16-BA+0.49 mg·L-1NAA+1.26 mg·L-12,4-D，平均不定芽個數(shù)達4.02個；最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+15 g·L-1蔗糖+5.0 g·L-1瓊脂粉+0.60 mg·L-1IBA+0.59 mg·L-1NAA+0.59 mg·L-1AC，生根率的平均值達91.5%。隨著黃精市場需求的持續(xù)旺盛，陜西略陽地區(qū)分布的野生黃精資源蘊藏量下降嚴重，目前國內(nèi)外對略陽黃精規(guī)范化快速繁殖栽培技術(shù)的相關(guān)報道極少，因此開發(fā)略陽黃精組培快繁技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值，但關(guān)于不同激素配比上的組合實驗，以及不同生長階段的組合實驗上有待于得出一個更好的、更加經(jīng)濟的優(yōu)化配方。