含復(fù)合防腐劑食品微生物檢驗(yàn)中稀釋液的選擇探討

吳澤君 石文松 賀晶 羅雨陽 陳陽桔 胡群

摘 要：目的：探索微生物檢驗(yàn)時(shí)，不同稀釋液對同時(shí)含山梨酸和苯甲酸鈉食品所具抑菌能力的影響。方法：制備不同pH且含山梨酸、苯甲酸質(zhì)量濃度比分別為3∶1、3∶2、3∶4食品模擬樣，分別以生理鹽水和含表面活性劑并具pH緩沖能力的溶液為稀釋液進(jìn)行稀釋，加菌作用30 min后檢測菌落總數(shù)，分析比較不同稀釋液對菌落生長的影響。結(jié)果：樣品pH較低時(shí)含表面活性劑稀釋液的菌落生長情況較好，pH較高時(shí)兩種稀釋液檢驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，兩種稀釋液對不同防腐劑濃度比例的影響未見明顯區(qū)別。結(jié)論：對較低pH復(fù)合防腐劑的樣品，建議以含表面活性劑并具pH緩沖能力的溶液作為稀釋液，減弱樣品所具抑菌能力，以利于菌體生長或修復(fù)。

關(guān)鍵詞：苯甲酸;山梨酸;微生物檢驗(yàn);稀釋液;抑菌

Abstract：Objective： To explore the effect of different diluent on the antibacterial ability of the food containing both sorbic acid and sodium benzoate during microbiological testing. Methods： To prepare food simulants with different pH and mass concentration ratios of sorbic acid and benzoic acid of 3∶1， 3∶2， and 3∶4， respectively， which then were diluted with physiological saline and a solution containing surfactants and pH buffering capacity. To detect the aerobic plate count of the dilutions after adding bacteria for 30 minutes， and analyze and compare the effects of different dilutions on colony growth. Results： The number of the colonies of the dilutions containing surfactant of the lower pH samples were more than that of the dilutions of other samples. No significant difference was found between the the influence of the two diluents when the pH was high， or among the samples with different concentration ratio of preservatives. Conclusion： It is recommended to use a solution containing surfactants and pH buffering capacity as a diluent for microbiological test of the samples with lower pH containing compound preservatives， so as to weaken the antibacterial ability and to facilitate bacterial growth or repair.

Key words：Benzoic acid; Sorbic acid; Microorganism examination; Diluent; Antibacterial

中圖分類號：TS207.4

防腐劑作為簡便有效的產(chǎn)品保質(zhì)措施被廣泛應(yīng)用多個(gè)行業(yè)中。受防腐劑抑菌作用影響，產(chǎn)品中多數(shù)微生物的生長繁殖被抑制，少部分被殺滅[1-2]，

還有部分成為非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but non-culturable，VBNC），處于VBNC的微生物仍可能存在一定危害，在一定條件下也可以誘導(dǎo)復(fù)蘇[3-4]。因此，微生物檢驗(yàn)中減弱防腐劑抑菌作用以及促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)的措施，可以更真實(shí)地體現(xiàn)樣品的微生物污染狀況。對復(fù)合添加山梨酸與苯甲酸的食品，在微生物檢驗(yàn)中探索不同稀釋液對其所具防腐劑抑菌能力的影響，有助于評估樣品的微生物污染狀況。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

某品牌果蔬飲料（未添加防腐劑）;卵黃卵磷脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、鹽酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、氯化鈉（AR），國藥集團(tuán);山梨酸鉀（含量99.5%）、苯甲酸鈉（含量99.5%）、吐溫-80（含量99.5%），上海麥克林公司;金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003），中國食品藥品檢定研究院。

高壓蒸汽滅菌鍋，二級生物安全柜，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，電子比濁儀，冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

添加山梨酸鉀、苯甲酸鈉于該飲料中，使山梨酸鉀、苯甲酸鈉的濃度質(zhì)量比分別為3∶1、3∶2、3∶4，濃度分別為0.15%和0.05%、0.15%和0.1%、0.15%和0.20%和。調(diào)節(jié)每個(gè)濃度模擬樣的pH分別為3.5、4.5、5.5。

1.2.2 稀釋液制備

0.85%氯化鈉溶液（A），含3%吐溫-80和0.3%卵磷脂的磷酸鹽溶液（磷酸二氫鉀3.56 g·L-1、磷酸氫二鈉5.77 g·L-1）（B）。

1.2.3 菌懸液制備

將接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂斜面上金黃葡萄球菌24 h新鮮培養(yǎng)物（第3代），以滅菌生理鹽水制備菌懸液，濃度約為2.5×104 CFU·mL-1。

1.2.4 檢驗(yàn)與數(shù)據(jù)處理

兩種稀釋液各取250 mL，分別加入1 mL菌懸液，混勻，室溫條件下作用30 min，各取1.0 mL檢驗(yàn)菌落總數(shù)，平行試驗(yàn)5次，比較兩者菌落生長的差別。

上述每種樣品各取2份（200 mL/份），各取25 mL

用不同稀釋液225 mL稀釋，混勻，作用30 min。分別加入1 mL菌懸液于稀釋后的樣品液中，混勻，室溫條件下作用30 min。每時(shí)間點(diǎn)稀釋液均各取1.0 mL檢驗(yàn)菌落總數(shù)。以等體積生理鹽水替代檢測樣作為陽性對照，以各稀釋液為空白對照，依法操作。平行試驗(yàn)5次，計(jì)算菌落數(shù)平均值。用IBM SPSS Statistics 20對菌落回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種稀釋液菌落回收比較

按α=0.05，兩種稀釋液加菌后的檢測結(jié)果比較

（見表1），其總體方差相等（F=0.142，P=0.716），其菌落均數(shù)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.179，P=0.061）。

2.2 含復(fù)合防腐劑樣品以不同稀釋液處理后的菌落數(shù)檢測結(jié)果

按α=0.05，pH3.5的樣品，稀釋液A處理更有利于菌落生長（FpH3.5=3 681.071，P=0.000）;pH4.5與pH5.5的樣品，用稀釋液A、B處理對菌落生長影響無區(qū)別（FpH4.5=3.170，P=0.059;FpH5.5=0.753，P=0.393）;各濃度比在相同pH時(shí)對菌落生長的影響無區(qū)別（FpH3.5=3.226，P=0.056;FpH4.5=2.641，P=0.116;FpH5.5=1.111，P=0.344）（見表2）。

3 討論與結(jié)論

山梨酸和苯甲酸實(shí)際應(yīng)用中常以鹽的形式添加于大多數(shù)產(chǎn)品中，其主要通過鈍化微生物相關(guān)酶的活性及破壞其功能[5]或干擾細(xì)胞的物質(zhì)傳遞[6]，從而干擾微生物的生長代謝及使菌體受損。微生物檢驗(yàn)對微生物生長存在干擾的情況常需通過恢復(fù)系統(tǒng)，解除微生物的生長抑制及促進(jìn)受損菌體恢復(fù)[7]，給予微生物良好的生長繁殖環(huán)境，可反映實(shí)際的微生物污染狀況。此情況在多類產(chǎn)品的微生物檢驗(yàn)中得到重視，藥品、化妝品等產(chǎn)品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定了相應(yīng)評估或消除、減弱防腐劑對微生物項(xiàng)目檢驗(yàn)結(jié)果影響的措施或方法[8-9]，

食品或保健食品等產(chǎn)品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)見相關(guān)討論或報(bào)道，認(rèn)為應(yīng)對此類情況予以重視[10-11]。

稀釋液是微生物檢驗(yàn)中促進(jìn)微生物生長的恢復(fù)系統(tǒng)的組成因素之一。與0.85%氯化鈉溶液比較，含3%吐溫-80和0.3%卵磷脂的磷酸鹽溶液對金黃色葡萄球菌生長無抑制，兩種稀釋液的菌落回收率無明顯差異。將兩者分別用于樣品稀釋處理及加金黃色葡萄球菌作用一定時(shí)間后研究發(fā)現(xiàn)，對pH3.5的樣品，含3%吐溫-80和0.3%卵磷脂的磷酸鹽溶液比0.85%氯化鈉溶液更有利于菌落生長。兩者菌落數(shù)以及回收率懸殊較大，前者可以較好地消除山梨酸和苯甲酸聯(lián)合抑菌能力，促進(jìn)菌體生長。對于pH4.5與pH5.5的樣品，兩種稀釋液的處理對菌落生長影響無明顯區(qū)別。分析其原因，樣品稀釋后，其防腐劑濃度降低，pH也發(fā)生一定變化。山梨酸和苯甲酸均為酸性防腐劑，質(zhì)子化形式存在是其產(chǎn)生抑菌能力的主要因素[7]，此隨著樣品pH值降低，其抑菌能力逐漸增加，越接近其pKa值，其質(zhì)子形態(tài)存在的物質(zhì)越多，抑菌能力越明顯;在低pH值時(shí)較小的濃度也具很好的抑菌能力[1]。有研究報(bào)道，質(zhì)量濃度為0.02%的山梨酸與苯甲酸復(fù)合防腐劑對大腸桿菌和金黃色葡萄菌的生長有較明顯的抑制作用[12]。在含3%吐溫-80和0.3%卵磷脂的磷酸鹽溶液的稀釋液中，吐溫-80、卵磷脂均為表面活性劑。吐溫-80具有很好的分散能力，可消除菌體吸附的防腐劑以及在其表面形成保護(hù)膜，卵磷脂為兩親分子結(jié)構(gòu)，有界面吸附能力，同樣可在菌體表面形成保護(hù)膜，避免或減少細(xì)胞損害[13];此外，吐溫-80可以介導(dǎo)受損菌體的復(fù)蘇[14]。以磷酸鹽所組成的緩沖體系對pH有較好的緩沖能力，樣品處理后其pH變動較大，質(zhì)子化狀態(tài)存在的物質(zhì)較少，使防腐劑發(fā)揮抑菌的作用較小。0.85%氯化鈉溶液對防腐劑抑菌能力的干擾，可能主要為防腐劑濃度的稀釋和樣品pH的變化，但其pH緩沖能力相對較弱，樣品處理后pH變動較小。因此pH3.5時(shí)，前者對防腐劑的抑菌能力發(fā)揮綜合干擾作用，使兩者的菌落生長情況相差較大;而pH4.5和pH5.5時(shí)，樣品經(jīng)兩者處理后，其pH變化可能均足以影響防腐劑發(fā)揮的抑菌能力，從而未體現(xiàn)明顯差別。相同pH時(shí)，同一稀釋液處理不同濃度比防腐劑組合的樣品，菌落生長的情況無明顯區(qū)別。對0.85%氯化鈉溶液來說，pH可能是主要的影響因素;而低pH時(shí)，復(fù)合稀釋液對不同濃度組合的防腐劑的抑菌能力均有很好的干擾作用。

含3%吐溫-80和0.3%卵磷脂的磷酸鹽溶液對聯(lián)用的山梨酸和苯甲酸具較好的消除或降低其抑菌能力的作用，尤其低pH時(shí)比0.85%氯化鈉溶液更更利于微生物的修復(fù)和生長，在樣品pH不明確時(shí)，使用前者可以更好地避免上述防腐劑對微生物檢驗(yàn)結(jié)果的干擾。

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（上接第頁）

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