重組大腸桿菌產(chǎn)Indigoidine的發(fā)酵優(yōu)化

孫菁蘭 王華敏 才恒 王麗娟 唐巧巧 劉之毅 高強(qiáng)

摘 要：Indigoidine是一種無(wú)毒的微生物天然藍(lán)色素。本研究利用重組大腸桿菌DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源比例及含量和兩階段控制溫度策略中的變溫點(diǎn)。結(jié)果表明：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。優(yōu)化后的變溫點(diǎn)為37 ℃培養(yǎng)7 h時(shí)變溫至28 ℃，Indigoidine產(chǎn)量增加了3倍，從初始的0.35 g·L-1提高至1.4 g·L-1。

關(guān)鍵詞：Indigoidine;培養(yǎng)基優(yōu)化;變溫發(fā)酵;大腸桿菌

Abstract：Indigoidine is a nontoxic microbial blue pigment. In this work， indigoidine was produced by fermentation of recombinant E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp. Single factor experiment was employed to optimize the proportion and content of compound nitrogen source in fermentation medium and the variable temperature point of two-stage temperature control strategy. The optimized fermentation medium was as following （g·L-1）： tryptone 5， yeast extract 10， NaCl 10， MOPS 5. The optimal culture time at 37 ℃ was 7 h and then the temperature change to 28 ℃. Production of indigoidine from the initial 0.35 g·L-1 increased up to 3-fold at 1.4 g·L-1.

Key words：Indigoidine; Medium optimization; Variable-temperature fermentation; Escherichia coli

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ920.6

Indigoidine是一種來(lái)自微生物的天然藍(lán)色素，有近70多年的發(fā)現(xiàn)歷史，因其無(wú)毒、色澤明亮類(lèi)似于靛藍(lán)，可作為新型天然藍(lán)色素及染料應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、染整等行業(yè)，已有將其用于蛋白質(zhì)類(lèi)纖維織物的染色報(bào)道[1]。在分子生物學(xué)研究中，Indigoidine合成酶基因可作為標(biāo)記基因構(gòu)建篩選體系[2-3]，近年來(lái)關(guān)于Indigoidine及其合成酶的應(yīng)用研究也開(kāi)始得到了重視[4]。

Indigoidine最早從植物病原菌歐文氏桿菌（Erwinia sp.）

中發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)其合成酶基因以沉默基因的形式存在[5]，經(jīng)其他宿主如大腸桿菌可異源表達(dá)并發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine[6-7]。Indigoidine合成酶（Indigoidine synthetase）是非核糖體肽合成酶，經(jīng)過(guò)4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活化，將微生物體內(nèi)的2分子谷氨酰胺合成為1分子Indigoidine[8]。該色素為非水溶性藍(lán)色素，具有抗菌性和氧化還原性，能溶解于少數(shù)的幾種有機(jī)溶劑，如DMF、DMSO、四氫呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等[9]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1（a），其

N，N-二甲基甲酰胺溶液在λ=590 nm處有最大吸收峰[2]，可被連二亞硫酸鈉還原為隱色體形式Lecoindigoidine[3，9]，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1（b）。

植物作為天然色素的生產(chǎn)者，雖然來(lái)源廣泛，但受自然環(huán)境影響大、含量低、生長(zhǎng)周期緩慢、加工成本高，因此植物源天然藍(lán)色素價(jià)格偏高[10]。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然藍(lán)色素可避免上述問(wèn)題，易于工業(yè)化生產(chǎn)。目前如利用三孢布拉霉生產(chǎn)的β-胡蘿卜素和番茄紅素，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素[11]已作為食品級(jí)微生物色素應(yīng)用于食品行業(yè)。利用微生物法發(fā)酵生產(chǎn)天然藍(lán)色素，在一定程度上可以緩解市場(chǎng)上天然藍(lán)色素稀缺的問(wèn)題，本文在成功表達(dá)idgS和sfp基因構(gòu)建產(chǎn)Indigoidine的重組大腸桿菌工程菌的基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)Indigoidine的發(fā)酵培養(yǎng)基與變溫點(diǎn)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏的一株含有Indigoidine合成酶基因（idgS）與4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因（sfp）的重組大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp，其中攜帶idgS和sfp基因的pCIMt002質(zhì)粒，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所陳義華研究員饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，1×105 Pa滅菌20 min;固體培養(yǎng)基含2%瓊脂。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5，pH 7.0，1×105 Pa滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨（生化級(jí)，英國(guó)OXOID品牌）;N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）;TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;SL 8型高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾（中國(guó)）科技公司];ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

將菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp經(jīng)三區(qū)劃線于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基活化，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)長(zhǎng)出白色單菌落，然后變溫至28 ℃培養(yǎng)6～8 h后，白色單菌落變?yōu)樗{(lán)色，挑取藍(lán)色較深的單菌落于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10～12 h，即為種子液。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

以1%（V/V）接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，發(fā)酵過(guò)程前期37 ℃培養(yǎng)4～10 h，后期28 ℃培養(yǎng)12 h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

1.4.3 發(fā)酵優(yōu)化

培養(yǎng)基氮源優(yōu)化：優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中胰蛋白胨與酵母浸粉的比例和含量;發(fā)酵變溫點(diǎn)優(yōu)化：選取產(chǎn)量較高的不同氮源比例的培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程前期37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別選擇4、6、7、8 h和10 h，后期

28 ℃培養(yǎng)12 h。

1.4.4 Indigoidine產(chǎn)量測(cè)定

（1）Indigoidine標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。發(fā)酵液經(jīng)離心取沉淀，用蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷依次清洗2次，將沉淀中的色素超聲溶解于DMF中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥的方法獲取Indigoidine粗品。將色素粗品溶解

于DMF，配成濃度為1 g·L-1的母液，梯度稀釋為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 g·L-1和0.500 g·L-1的色素溶液，在λ=590 nm處測(cè)量色素溶液吸光度值，重復(fù)3次（下同），制作Indigoidine標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2）。

（2）Indigoidine產(chǎn)量計(jì)算。取發(fā)酵液50 mL于離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，棄上清，用蒸餾水清洗沉淀2次。向沉淀中加入3 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），超聲1 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清色素溶液。在λ=590 nm處測(cè)量色素溶液吸光度值，若OD590大于0.8，則稀釋至0.2～0.8 g·L-1范圍內(nèi)測(cè)定，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得出Indigoidine產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基氮源含量?jī)?yōu)化

按照1.4.2的方法，發(fā)酵前期37 ℃培養(yǎng)4 h后變溫至28 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定發(fā)酵液中Indigoidine的產(chǎn)量。由圖3可知，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量為0.35 g·L-1，當(dāng)胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10、0∶15時(shí)產(chǎn)量最高分別為0.55 g·L-1、0.57g·L-1，其次是胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的產(chǎn)量為0.44 g·L-1，上述3個(gè)比例的菌體濃度與色素產(chǎn)量都大于對(duì)照。

2.2 發(fā)酵變溫點(diǎn)優(yōu)化

由于2.1中37 ℃培養(yǎng)4 h后變溫，未能真正反映菌體產(chǎn)色素能力的真實(shí)水平。因此下一步實(shí)驗(yàn)選擇上述3個(gè)產(chǎn)量較高的復(fù)合氮源比例，比較其在多個(gè)變溫點(diǎn)下的Indigoidine產(chǎn)量。由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中同一比例的蛋白胨與酵母浸粉在不同變溫點(diǎn)下產(chǎn)量差異顯著。變溫點(diǎn)為4 h時(shí)，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為0∶15時(shí)產(chǎn)量最高為0.56 g·L-1，但在6～8 h時(shí)，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10時(shí)，色素產(chǎn)量最大，其中變溫點(diǎn)為7 h時(shí)，產(chǎn)量最高為1.4 g·L-1。在各變溫點(diǎn)下，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的色素產(chǎn)量較5∶10低，可能是菌體濃度過(guò)高，發(fā)酵液相對(duì)黏稠，溶氧下降的原因。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的比例及含量為胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）=5∶10，變溫點(diǎn)為37 ℃培養(yǎng)7 h后變溫至28 ℃。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)合氮源比例及含量和變溫發(fā)酵的變溫點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，得到最終發(fā)酵培養(yǎng)基組成（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。最終發(fā)酵條件：初始pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL、37 ℃培養(yǎng)7 h時(shí)變溫至28 ℃培養(yǎng)12 h，發(fā)酵全程搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。

采用兩階段控制溫度策略，前期利于菌體生長(zhǎng)，后期滿足菌體產(chǎn)素需求，發(fā)酵周期較短。優(yōu)化后的Indigoidine

產(chǎn)量增加了3倍，達(dá)到了1.4 g·L-1。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院微生物研究所陳義華研究員饋贈(zèng)含有idgS和sfp基因的pCIMt002質(zhì)粒、感謝天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院謝周杰副研究員在Indigoidine

相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)，感謝本實(shí)驗(yàn)室唐巧巧同學(xué)在重組大腸桿菌工程菌E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp構(gòu)建方面的工作。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊葉東，田麗，陳燦軍，等.拼色后的天然藍(lán)色素indigoidine對(duì)蛋白質(zhì)纖維織物染色的方法：中國(guó)，CN108894014A[P].2018-11-27.

[2]Xie Z J，Zhang Z，Cao Z J，et al.An external substrate-free blue/white screening system in Escherichia coli[J].Applied Microbiology & Biotechnology，

2017，101（9）：3811-3820.

[3]Müller M，Ausl?nder S，Ausl?nder D，et al.

A novel reporter system for bacterial and mammalian cells based on the non-ribosomal peptide indigoidine[J].Metabolic Engineering，2012，14（4）：325-335.

[4]孫菁蘭，朱玉章，王華敏，等. 大腸桿菌異源表達(dá)的indigoidine與靛藍(lán)的穩(wěn)定性比較[EB/OL].（2020-09-25）[2020-09-09].https：//kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx？dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=WSWT20200924002&v=5O1hyDJ8vxQv7oShyn849OHa2Xh2jbMFfPKcYVsSGWDgcQJz5g52m5u60dhDorsG.

[5]Li P W，Li J，Guo Z Y，et al.An efficient blue-white screening based gene inactivation system for Streptomyces[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（4）：1923-1933.

[6]Xu F C，Gage D，Zhan J X.Efficient production of indigoidine in Escherichia coli[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2015，42（8）：1149-1155.

[7]Yu D Y，Xu F C，Valiente J，et al.An indigoidine biosynthetic gene cluster from Streptomyces chromofuscus ATCC 49982 contains an unusual IndB homologue[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2013，40（1）：159-168.

[8]Takahashi H，Kumagai T，Kitani K，et al.Cloning and characterization of a Streptomyces single module type non-ribosomal peptide synthetase catalyzing a blue pigment synthesis[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（12）：9073-9081.

[9]Heumann W，Young D，Gottlich C.Leucoindigoidine formation by an Arthrobacter species and its oxidation to indigoidine by other microorganisms[J].Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects，1968，

156（2）：429-431.

[10]王君，張寶善.微生物生產(chǎn)天然色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（3）：183-186.

[11]徐春明，王曉丹，焦志亮.食用微生物色素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑，2015（2）：162-168.