全腦缺血-再灌注大鼠腦組織中DADLE濃度的測定*

謝慧，武釗，吳琳英，趙凱，李霜，歐陽斌，黃偉青

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510120；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，昆明 650032；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，廣州 510120；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會，廣州 510120)

心臟驟停是急診醫(yī)學(xué)中常見的急癥之一，因其居高不下的致死率及致殘率給社會和家庭造成嚴(yán)重威脅。自2010年開始，國際心肺復(fù)蘇指南著重強調(diào)對于自主循環(huán)恢復(fù)后的高級生命支持。其中，以腦復(fù)蘇為重點的后期復(fù)蘇階段的處理，一直是國內(nèi)外研究的熱門課題。心臟驟停后引起的腦損害的病理生理主要是缺血缺氧性腦損傷以及自主循環(huán)恢復(fù)后的大腦缺血-再灌注損傷，近年研究發(fā)現(xiàn)，δ阿片受體激動劑可以誘導(dǎo)心肌冬眠和加強對缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。人工合成的δ阿片受體激動劑[d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 腦啡肽[(d-Ala2，d-Leu5)enkephalin，DADLE]在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域的作用也逐漸得到重視[1]。DADLE對全腦缺血經(jīng)藥物處理保護(hù)作用是否具有濃度相關(guān)性，筆者尚未見研究[2]。因此，筆者在本研究旨在建立一種快速、簡便的大鼠腦組織液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量檢測方法，并應(yīng)用于全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織中DADLE濃度的檢測，為探索DADLE的腦組織保護(hù)作用與其濃度之間是否存在量效關(guān)系提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1儀器 島津超高效液相色譜儀(Nexera UHPLC LC-30A)，菲羅門公司C18色譜柱(2.0 mm×50 mm，5 μm)。美國AB公司API 4000液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，AnaLyst 1.6數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；Millipore Simplicity純水機； BT25S電子天平(賽多利斯儀器公司，感量：0.01mg)；湘儀H1750臺式高速離心機；冠森XH-D旋渦混合器；容聲BCD-229S/EA電冰箱。

1.2樣品與試劑 [d-丙氨酸2，d-亮氨酸5] 腦啡肽(DADLE)對照品(貨號：D193335，純度≥95%，多倫多研究化學(xué)品公司)；甲醇為色譜純(色譜純，F(xiàn)isher公司)；甲酸(質(zhì)譜級，Thermo Fisher公司)，實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(粵)2016-0167。于室內(nèi)溫度(23±1.5) ℃、相對濕度(65±10)%環(huán)境中，12 h日夜交替照明，正常飲食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.4色譜條件 色譜柱為Gemini C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為水相(含0.1%甲酸水溶液)；流動相B為有機相(含0.1%甲酸甲醇溶液)。流速為0.4 mL·min-1，梯度洗脫：0～0.3 min，5%B；>0.3～0.6 min，5%→95%B，>0.6～2.1 min，95%B，>2.1～2.6 min，95%→5%B，>2.6～4 min，5%B。

1.5質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下，多離子監(jiān)控模式(multi reaction monitoning，MRM)，DADLE檢測離子對為m/z570.2→120.4及570.2→136.3，毛細(xì)管電壓5500 V，碰撞能54V(圖1)。

1.6溶液配制 精密稱取并配置DADLE母液1 mg·mL-1(50%甲醇)，臨用前使用空白腦組織稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品。

1.7腦組織取樣及樣品處理 在規(guī)定時間點，抓取大鼠并處死，沿枕骨內(nèi)壁中線剪開顱骨暴露大腦，取完整腦組織置于研缽，加入適量液氮研磨勻漿后迅速置入1.5 mL離心管，-20 ℃凍存待測。檢測時將腦組織樣品置于常溫融化后，取腦組織樣品100 μL，加入甲醇-水(1：1)5 μL，渦旋混合，加入甲醇200 μL，渦旋混合，14 000×g離心30 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

1.8全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織濃度實驗 采用前期已建立的二血管阻斷加低血壓法構(gòu)建全腦缺血-再灌注大鼠模型[3-5]。造模成功后，單次經(jīng)左側(cè)頸靜脈給藥，給藥劑量為2，5，10 mg·kg-1，于給藥后10，120 min處死小鼠，取腦組織，按“1.7”項下方法處理分析進(jìn)樣。

圖1 DADLE二級碎片特征子離子全掃描

2 結(jié)果

2.1方法選擇性 取6個不同個體的空白腦組織100 μL，按“1.7”項下操作，進(jìn)樣 10 μL，得空白腦組織樣品色譜圖；配制0.1 ng·mL-1濃度的腦組織樣品，依同法操作，DADLE的保留時間約為1.5 min。結(jié)果表明腦組織樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾DADLE的測定(圖2)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 取空白腦組織，配制成相當(dāng)于DADLE腦組織濃度依次為1.00，2.0，5.0，20，100，500和 1000 ng·mL-1的樣品，按“1.7”項下依法操作。以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物的峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，求得的直線回歸方程為Y=940.6660X-255.5192(r=0.995 2)。DADLE在0.1～1000 ng·mL-1線性關(guān)系良好，定量下限0.1 ng·mL-1，精密度為13.5%，相對誤差為2.0%。

2.3精密度與準(zhǔn)確度 取空白腦組織配制的低、中、高3個濃度(DADLE腦組織濃度分別為2.0，20和800 ng·mL-1)的質(zhì)量控制(quality control,QC)樣品，每一濃度進(jìn)行 6樣本分析，連續(xù)測定3個批次，根據(jù)當(dāng)批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算QC樣品的測得濃度計算本法的準(zhǔn)確度與精密度(表1)。LC-MS/MS外標(biāo)法測得DADLE在每一QC濃度水平的日內(nèi)精密度RSD<10.0%，日間精密度RSD<11.6%，準(zhǔn)確度在95.81%～99.19%。

圖2 空白腦組織(A)及0.1 ng·mL-1 DADLE(B)色譜圖

表1 DADLE在大鼠腦組織中的精密度與準(zhǔn)確度

2.4回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取空白腦組織配制的低，中，高濃度QC樣品(腦組織中DADLE濃度分別為2.0，20和800 ng·mL-1)。同時另取空白腦組織及超純水各100 μL，按“1.7”項下操作，向獲得的全部上清液中分別加入低、中、高濃度對照品溶液5.0 μL，渦流混合后，14 000×g離心30 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積。以每一濃度不同處理方法的峰面積比值計算處理回收率及基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明低、中、高QC樣品處理回收率分別為(66.1±8.4)%，(72.3±5.5)%，(78.4±0.95)%，RSD分別為12.7%，8.8%，1.2%；基質(zhì)效應(yīng)分別為(104.0±12.6)%，(97.9±4.8)%，(91.3±3.7)%，RSD分別為12.1%，7.3%，4.0%。

2.5穩(wěn)定性實驗 本實驗考察DADLE腦組織樣品室溫放置6 h的穩(wěn)定性、經(jīng)蛋白沉淀處理后在自動進(jìn)樣器放置24 h的穩(wěn)定性、腦組織樣品經(jīng)歷三次冷凍-解凍循環(huán)、腦組織樣品-80 ℃ 放置30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示DADLE在上述條件下穩(wěn)定性良好。

表2 DADLE在大鼠腦組織中的穩(wěn)定性考察

2.6全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織濃度實驗 模型大鼠單次經(jīng)左側(cè)頸靜脈給藥后10，20 min腦組織DADLE濃度見表3。檢測結(jié)果提示經(jīng)頸靜脈給藥10 min后，大鼠腦組織中DADLE濃度均處于較低水平(0.13～0.79 ng·mL-1)。在給藥20 min后，DADLE在腦組織中水平有所提高(1.33～2.94 ng·mL-1)。單因素方差分析顯示劑量對DADLE在腦組織中的濃度具有顯著影響(P<0.05)。但給藥10 min后，腦組織中DADLE的濃度水平與劑量呈反相關(guān)，高劑量10 mg·kg-1組中濃度平均水平僅為(0.13±0.10) ng·mL-1。給藥20 min后，腦組織中DADLE濃度水平隨劑量增加而提升，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.77，P=0.008)。

表3 全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織DADLE濃度

Tab.3 Concentration of DADLE in brain tissue of global cerebral ischemia-reperfusion model rats

表3 全腦缺血-再灌注模型大鼠腦組織DADLE濃度

劑量/(mg·kg-1)給藥后10 min給藥后20 min20.79±0.531.33±0.4550.46±0.412.23±1.10100.13±0.102.94±1.41

3 討論

δ-阿片受體激動劑DADLE具有誘導(dǎo)心肌冬眠[6]，心臟、大腦、肺等器官缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[7-8]。無論是心臟驟停還是腦梗死，缺血-再灌注損傷均是克服缺氧缺血性腦損傷的中心環(huán)節(jié)[9]。在外源性藥物對腦組織缺血-再灌注損傷的防護(hù)以外，中樞δ阿片受體的激活則在內(nèi)源性保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，人工合成的δ阿片受體激動劑DADLE有望通過外源性途徑增強腦組織缺血-再灌注的內(nèi)源性保護(hù)作用。本課題組前期研究中實踐一種二血管阻斷加低血壓手段建立全腦缺血-再灌注大鼠模型。并在這種方法所構(gòu)建的全腦缺血-再灌注的模型大鼠中發(fā)現(xiàn)DADLE可通過增加絲/蘇氨酸蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活化，抑制凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3(cysteinyl asparatate specific proteinase 3)、Bax(Bcl-2 associated X)、Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)的表達(dá)程度，減少細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生腦保護(hù)等臟器保護(hù)作用[3-5]。

3.1大鼠腦組織中DADLE檢測方法的選擇 針對DADLE的定量檢測方法，多為基于液相系統(tǒng)的分析測試方法，如高效液相色譜-紫外光譜法、高效液相色譜-熒光光譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]。而腦組織中DADLE含量檢測面臨著更低檢測限的挑戰(zhàn)。此外，采用高效液相色譜-熒光光譜法涉及DADLE的柱前熒光衍生，雖然利用多維液相系統(tǒng)、固相萃取前處理方法能夠增加檢測方法的靈敏度，但同時也增加樣品前處理的復(fù)雜性和檢測時間。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于具有較高的靈敏度、選擇性，成為檢測低濃度DADLE的適宜方法。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜作為分析手段。考慮到處理動物、取腦組織、勻漿等復(fù)雜的取樣過程，在腦組織樣品的前處理部分，筆者采用簡便、快捷的蛋白沉淀法。經(jīng)驗證，蛋白沉淀前處理方法配合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法可滿足DADLE在腦組織中的定量分析要求，最低定量限低至0.1 ng·mL-1。該方法簡便、靈敏，可滿足體內(nèi)DADLE在低濃度分布組織中的定量檢測需求。

3.2定量方法的選擇 目前對DADLE的缺血-再灌注保護(hù)作用的研究多集中在體外實驗。由于其濃度水平高，檢測方法多為液相色譜-光譜法[10-11]。而對腦組織中DADLE含量測定，由于其低濃度水平，液相色譜-光譜法及液相色譜-質(zhì)譜法均有報道。在液相色譜-質(zhì)譜法中，報道均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以減少操作及檢測條件波動的影響[12]。然而，內(nèi)標(biāo)法對內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具有一定的要求，如結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)與分析物類似，但又可以分離。同時對實驗人員的操作也有一定的要求。為了提高腦組織中DADLE含量測定的可操作性，本研究嘗試使用DADLE對照品，在完全相同的操作下，使用外標(biāo)法對腦組織中DADLE進(jìn)行定量分析。通過線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)等指標(biāo)的驗證，本方法證實為一個簡便、易操作的腦組織DADLE定量檢測方法。

3.3液相質(zhì)譜方法條件摸索 本方法采用常規(guī)的水-甲醇體系作為流動相。在其中加入0.1%甲酸以適應(yīng)質(zhì)譜離子源正離子模式并控制噴霧酸堿值。在預(yù)實驗中，也顯示含0.1%甲酸的水-甲醇體系用于腦組織樣品測定時，較水-乙腈體系具有更少的干擾，基線和色譜峰形較好。質(zhì)譜采用MRM，在碰撞能54 V條件下，選取兩個碎片離子的離子對(m/z570.2→136.3、m/z570.2→120.4)對DADLE進(jìn)行監(jiān)測。除了文獻(xiàn)報道的離子對m/z570.2→136.3以外，考慮到本研究采用外標(biāo)法，增加m/z570.2→120.4離子對來對DADLE進(jìn)行共同監(jiān)測，通過兩個離子對的共同監(jiān)測，可排除其他離子干擾，保障對DADLE的高選擇性。本方法檢測腦組織中DADLE的濃度，由于腦組織脂溶性成分較高，在前期使用乙酸乙酯液液萃取法進(jìn)行前處理樣品干擾物質(zhì)偏多，且回收率偏低，最低檢測限偏高。因此，采用在樣品前處理步驟，筆者采用簡單的甲醇沉淀蛋白方法，經(jīng)過驗證，該方法簡便，回收率可達(dá)到66%以上。本方法對腦組織基質(zhì)效應(yīng)的考察中顯示，3個濃度質(zhì)控樣品其基質(zhì)效應(yīng)控制在91.3%～104%，這可能是由于本方法色譜分離時間控制在4 min，且采用梯度洗脫的液相方法，減少DADLE保留時間時的共流出物成分有關(guān)。雖然有報道指出，前處理采用固相萃取的方法能夠有效降低檢測的基質(zhì)效應(yīng)[12]。但本研究證明在本方法的條件下，簡便的蛋白沉淀前處理方法能夠提供不劣于復(fù)雜固相萃取前處理的效果。

3.4檢測方法的應(yīng)用與結(jié)果分析 在二血管阻斷加低血壓法建立全腦缺血-再灌注模型大鼠中，前期研究經(jīng)頸靜脈給藥后10，20 min大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化。因此，筆者檢測2，5，10 mg·kg-1劑量下經(jīng)頸靜脈注射給藥10，20 min后腦組織中DADLE的含量，并對照蛋白表達(dá)水平評分初步探索這種變化是否具有一定的相關(guān)性。雖然DADLE在腦組織中的水平受到劑量的顯著影響，但給藥10 min后中、高劑量組DADLE濃度水平反而較低，而給藥20 min后，腦組織中濃度又與給藥劑量水平呈現(xiàn)一致趨勢。除了因?qū)嶒瀯游飩€體導(dǎo)致的差異以外，筆者推測DADLE需要一定時間完成由頸靜脈跨越血腦屏障到達(dá)腦脊液，再分布到全腦組織這一過程。這一分布的快慢還可能受到腦血流量、腦組織脂肪含量、血腦屏障藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)水平等的影響。這一結(jié)果為后續(xù)研究DADLE腦組織保護(hù)的量效關(guān)系中，采樣時間點的設(shè)置提供了寶貴經(jīng)驗。在初步的相關(guān)性分析中，Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平與給藥20 min后DADLE腦組織濃度之間存在一定的指數(shù)型線性關(guān)系[Y=0.99ln(X)+0.61，R2=0.999 9]。而明確DADLE腦組織保護(hù)作用的量效關(guān)系模式尚需要進(jìn)一步的研究，包括明確DADLE在大鼠腦組織中分布代謝消除時間，以及在這個過程中相關(guān)信號通路中蛋白表達(dá)水平的動態(tài)變化。而本方法的建立則提供一個快速、簡單、專屬性強的液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜的定量檢測方法，為后續(xù)探索DADLE腦組織保護(hù)作用的量效關(guān)系提供較好的技術(shù)支撐。