蝦青素通過抗氧化作用改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

劉翀，朱寧偉，蔣曉梅

(1.浙江省麗水市中心醫(yī)院藥學(xué)部，麗水 323000；2.浙江省醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，寧波 315100)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是老年期癡呆的常見類型之一，是由于腦組織長(zhǎng)期處于各種缺血缺氧性損傷導(dǎo)致的獲得性智能障礙綜合征[1]。隨著全球人口的老齡化，血管性癡呆患病率呈指數(shù)上升，給個(gè)人、家庭和社會(huì)都帶來負(fù)擔(dān)。因此，尋找治療和預(yù)防血管性癡呆藥物具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。蝦青素是目前抗氧化能力較強(qiáng)的天然藥物，且能通過血腦屏障，其強(qiáng)大的抗氧化能力對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[2]。目前蝦青素在缺血-再灌注等缺血模型中作用有大量的研究，而在血管性癡呆模型研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈建立小鼠血管性癡呆模型，研究蝦青素對(duì)血管性癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3個(gè)月齡健康雄性ICR清潔級(jí)小鼠60只，體質(zhì)量(30±5)g，由浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。實(shí)驗(yàn)期間所有動(dòng)物晝夜室溫控制在約22 ℃，明暗各12 h交替，均予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2藥品與試劑 蝦青素(寧波博奧科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)：20180326，含量≥98%)，超氧化物歧化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào)分別為：S0103，S0131)，ROS熒光探針-DHE購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(ROS熒光探針批號(hào)：S0063)。

1.3儀器與設(shè)備 Morris水迷宮系統(tǒng)(中國(guó)成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：WMT-100S)，石蠟切片機(jī)(Leica公司，型號(hào)：RM2235型)，CO2培養(yǎng)箱(中國(guó)力康發(fā)展有限公司，型號(hào)：HF160W型)，共聚焦激光掃描顯微鏡(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：SP5型)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher，型號(hào)：Multiskan)。

1.4血管性癡呆動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈法制作模型。用4%水合氯醛[1 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉小鼠，從小鼠頸部正中切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出肌肉及筋膜，統(tǒng)一將右側(cè)頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)輕輕剝離后進(jìn)行兩端結(jié)扎，結(jié)扎結(jié)束后剪斷頸總動(dòng)脈，左側(cè)頸總動(dòng)脈不做處理，縫合切口，術(shù)后于傷口處撒少量青霉素粉末(每瓶80萬U)。假手術(shù)組除不結(jié)扎及切斷右側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余操作與手術(shù)組相同。將手術(shù)組存活小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成模型對(duì)照組、蝦青素(50，100和200 mg·kg-1)4個(gè)組，每組11只。手術(shù)過程中5只死亡，死亡率為8%。另設(shè)假手術(shù)組11只。

1.5蝦青素溶液的配制及給藥方法配制 3組劑量蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液：稱量蝦青素于15 mL離心管中，加入為0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，最終配制成蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液。超聲混懸20 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。灌胃給藥：小鼠手術(shù)休息5 d后開始灌胃給藥。根據(jù)小鼠體質(zhì)量分別給予50，100，200 mg·kg-1蝦青素，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予羧甲基纖維素鈉溶液，所有小鼠均按0.1 mL·kg-1每天灌胃1次，持續(xù)給藥1個(gè)月。

1.6Morris水迷宮行為學(xué) 觀察所有小鼠灌胃給藥1個(gè)月后，進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)室保持光線昏暗及周圍環(huán)境安靜狀態(tài)。將水池平分為4個(gè)象限，將平臺(tái)放置在1個(gè)象限的固定地方，令水面高出平臺(tái)2 cm，水溫保持在(24±2) ℃。將各組小鼠從同一象限放入水中，錄像記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，若大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，實(shí)將其放上平臺(tái)并保持10 s，將其從平臺(tái)上取下休息20 s后，依次進(jìn)入下一象限實(shí)驗(yàn)。若小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，令其在平臺(tái)上休息10 s后取下，其余操作同前，持續(xù)5 d重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)視頻分析軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)，分析平均速度和平均逃避潛伏期。

1.7強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 所有小鼠灌胃干預(yù)1個(gè)月后，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。第1天將小鼠置于游泳桶中游泳 15 min進(jìn)行，游泳桶尺寸為15 cm×25 cm，取出后烘干，歸籠。第2天，在同樣的條件下進(jìn)行強(qiáng)迫游泳6 min，記錄后4 min在水中靜止不動(dòng)時(shí)間。靜止不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)為小鼠只將頭部露出水面漂浮于水面，除了避免沒入水中而向上的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)外，無其他行為，不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，表明動(dòng)物越絕望。

1.8Nissl染色 水迷宮實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠，取部分腦組織置于4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片后制作成切片厚度5 μm，按Nissl染色試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，剩余腦組織-20 ℃保存?zhèn)溆糜糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.9SOD和MDA檢測(cè) 取各組小鼠海馬組織，按每10 mg加入SOD樣品制備液100 μL，比例在4 ℃或冰浴進(jìn)行勻漿。隨后在4 ℃離心機(jī)12 000×g離心3～5 min，取上清液作為待測(cè)樣品。按照BAC試劑盒步驟測(cè)定樣本蛋白濃度。然后根據(jù)SOD和MDA檢測(cè)按照試劑盒說明書步驟測(cè)定樣品中SOD活力和MDA含量。

1.10活組織ROS熒光探針-DHE染色 小鼠麻醉后迅速處死取腦，沿海馬槽走向連續(xù)冠狀面切片，切片厚度400 μm。將腦片放入持續(xù)通入混合氧氣的人工腦脊液中靜置15 min后，隨后按照試劑盒說明書進(jìn)行染色，染料濃度5 nmol·L-1，CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，孵育結(jié)束后立即置于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1平均速度 各組小鼠平均運(yùn)動(dòng)速度均隨著訓(xùn)練天數(shù)增加而降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組內(nèi)每日平均運(yùn)動(dòng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)，說明小鼠運(yùn)動(dòng)能力無差異，排除因小鼠的運(yùn)動(dòng)能力影響尋找平臺(tái)時(shí)間。

2.2平均逃避潛伏期 各組小鼠5 d的逃避潛伏期時(shí)間見圖2，假手術(shù)組平均逃避潛伏期時(shí)間隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加而縮短。模型對(duì)照組平均逃避潛伏期在第3天有所下降，5 d的平均逃避潛伏期時(shí)間均高于假手術(shù)組。蝦青素組小鼠平均逃避潛伏期時(shí)間均隨著訓(xùn)練天數(shù)增加而縮短，蝦青素組200 mg·kg-1在第4和第5天的平均逃避潛伏期時(shí)間較模型對(duì)照組顯著下降(P<0.05)與假手術(shù)組走勢(shì)相似；蝦青素50，100 mg·kg-1兩組小鼠平均逃避潛伏期與模型對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 5組小鼠平均運(yùn)動(dòng)速度

2.3強(qiáng)迫游泳時(shí)間強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖3所示，與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組(P<0.01)、蝦青素組50 mg·kg-1(P<0.05)及100 mg·kg-1(P<0.05)在水中靜止不動(dòng)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)。相比于模型對(duì)照組，應(yīng)用蝦青素組小鼠的水中靜止時(shí)間均有所下降，其中應(yīng)用蝦青素組200 mg·kg-1水中靜止不動(dòng)的時(shí)間與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.01；②與假手術(shù)組比較，P<0.05；③與假手術(shù)組比較，P<0.01。

2.4Nissl染色Nissl染色結(jié)果 見圖4，模型對(duì)照組小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞，尤其在CA1和CA3區(qū)，神經(jīng)元固縮且深染，細(xì)胞周圍間隙增大呈空泡樣變。假手術(shù)組小鼠細(xì)胞排列層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，尼氏體呈深藍(lán)色。蝦青素3個(gè)劑量組小鼠海馬結(jié)構(gòu)細(xì)胞排列整齊且層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，尼氏體呈深藍(lán)色，空泡樣變消失，尤其在CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元改善較為明顯。

2.5檢測(cè)海馬中SOD和MDA含量 模型對(duì)照組小鼠海馬組織中 SOD 活力值比假手術(shù)組顯著下降(P<0.05)，而MDA含量顯著升高(P<0.05)。相比于模型對(duì)照組，蝦青素3個(gè)劑量組均能提高SOD活力值，降低MDA含量，且呈劑量依賴性。蝦青素組200 mg·kg-1SOD活力值較模型對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而MDA值顯著降低(P<0.05)。蝦青素組100及50 mg·kg-1的SOD值及MDA值與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

2.6檢測(cè)小鼠海馬三亞區(qū)ROS熒光 各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3和DG區(qū)ROS熒光強(qiáng)度存在組間差異，假手術(shù)組3個(gè)亞區(qū)ROS熒光強(qiáng)度均低于模型對(duì)照組，且CA1區(qū)和CA3區(qū)的差異最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說明單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)引起海馬3個(gè)亞區(qū)中ROS高；蝦青素3個(gè)劑量組灌胃后，蝦青素組200 mg·kg-1小鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3和DG區(qū)中ROS熒光強(qiáng)度均暗于其他兩個(gè)劑量組，與模型對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(在CA1區(qū)P<0.01，在CA3和DG區(qū)均P<0.05)；而蝦青素組50 mg·kg-1和蝦青素組100 mg·kg-1海馬結(jié)構(gòu)中3個(gè)亞區(qū)的ROS熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組均有所下降相似，但與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

3 討論

參考國(guó)內(nèi)外研究并無蝦青素給藥的劑量，大部分選擇25 mg·kg-1到100 mg·kg-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]，因此本次實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置50，100，200 mg·kg-1(小、中、大)3個(gè)劑量組來探討蝦青素對(duì)VD小鼠的影響。

VD是指大腦中對(duì)記憶、認(rèn)知和行為至關(guān)重要區(qū)域損傷引起的認(rèn)知功能喪失，在一定程度上會(huì)影響日常生活[4]，目前并沒有有效的防治方法。已有研究報(bào)道蝦青素對(duì)缺血引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)蝦青素還能通過哺乳動(dòng)物的血腦屏障[5]，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種潛在治療VD的藥物。本次實(shí)驗(yàn)通過灌胃給予不同劑量蝦青素，考察藥物對(duì)于VD的防治作用。

圖4 5組小鼠海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3和DG區(qū)尼氏染色(Bar：100 mm)

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

本實(shí)驗(yàn)采用永久性結(jié)扎單側(cè)頸總動(dòng)脈建立VD模型，實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)一結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈(RUCCAO)，保留左側(cè)，小鼠的死亡率約為8%。術(shù)后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，模型對(duì)照組的平均逃避潛伏期時(shí)間及在水中的靜止時(shí)間均顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)，且平均逃避潛伏期時(shí)間在第3天后兩組時(shí)間差距變大，這表明兩組小鼠在學(xué)習(xí)記憶能力上具有顯著差異。Nissl染色結(jié)果表明模型對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，尤其在CA1和CA3區(qū)。上述行為學(xué)結(jié)果和形態(tài)學(xué)結(jié)果都證實(shí)采用永久性結(jié)扎單側(cè)頸總動(dòng)脈能導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，并損害神經(jīng)元，可用于的血管性癡呆小鼠模型建立。

藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，蝦青素3個(gè)劑量組平均逃避潛伏期時(shí)間及水中的靜止時(shí)間均低于模型對(duì)照組，其中蝦青素組200 mg·kg-1是3個(gè)劑量組中改善最明顯的與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，Nissl染色結(jié)果表明，給予AST后VD小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元損傷較模型對(duì)照組明顯減輕，說明灌胃給藥蝦青素能夠減少VD小鼠海馬神經(jīng)元損傷從而改善其學(xué)習(xí)記憶能力，且作用呈劑量依賴性。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)還對(duì)蝦青素治療VD的機(jī)制進(jìn)行了考察。蔣青等[6]認(rèn)為氧化應(yīng)激在血管性癡呆發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。正常情況下氧自由基會(huì)被機(jī)體自身的抗氧化物質(zhì)如 SOD 清除，維持氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡；而長(zhǎng)期處于低氧低灌注的條件下，抗氧化物質(zhì)的大量消耗導(dǎo)致羥自由基(·OH)等ROS積累，從而造成氧化應(yīng)激損傷，是引起VD的重要機(jī)制。聚集在體內(nèi)的ROS氧化生物膜誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起MDA和GSH含量以及SOD活性異常，最終損傷神經(jīng)元[7]。因此體內(nèi)ROS、SOD及 MDA含量能直接反映了氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度。本研究證實(shí)，血管性癡呆小鼠海馬結(jié)構(gòu)中ROS含量和MDA含量較假手術(shù)組明顯升高，而SOD 活力值顯著下降，說明血管性癡呆小鼠腦內(nèi)存在著明顯的氧化應(yīng)激損傷。而蝦青素3個(gè)劑量組小鼠海馬結(jié)構(gòu)中ROS熒光強(qiáng)度和MDA含量均低于模型對(duì)照組，SOD活力值高于模型對(duì)照組，且蝦青素組200 mg·kg-1效果最為明顯。說明蝦青素能夠通過抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制對(duì)VD引起的認(rèn)知功能障礙發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。其原因可能是蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化性，能夠通過其抗氧化作用在多種疾病模型中發(fā)揮治療作用[8]。如蝦青素可以通過改變MDA、 GSH含量以及SOD活性來改善蛛網(wǎng)膜下腔出血，減輕早期腦損傷等[9]。

另外，本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Nissl染色中，模型對(duì)照組海馬三區(qū)神經(jīng)元損傷以CA1區(qū)和CA3區(qū)最為嚴(yán)重，在DHE染色結(jié)果中，模型對(duì)照組海馬三區(qū)ROS水平以CA1和CA3區(qū)顯著高于假手術(shù)組。這一結(jié)果表明，在缺血狀態(tài)下海馬三區(qū)CA1和CA3區(qū)極容易受損。蝦青素干預(yù)后，海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元改善明顯，且兩亞區(qū)ROS水平降低異常顯著。盡管3個(gè)給藥組改善海馬神經(jīng)元損傷效果相似，但分子生物學(xué)存在差異。這潛在的機(jī)制為后續(xù)研究提供了思路。

綜上所述，蝦青素能通過清除活性氧自由基、恢復(fù)抗氧化酶的活性等抗氧化作用來改善血管性癡呆小鼠模型認(rèn)知功能，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，且作用具有劑量依賴性，為蝦青素預(yù)防和治療血管性癡呆提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。