解毒抗癌巴布劑中主要成分體外釋放度及離體小鼠經(jīng)皮滲透行為研究*

黃文濤，張耕，胡松，楊全偉

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

解毒抗癌巴布劑為武漢市中醫(yī)院腫瘤科臨床使用多年的協(xié)定處方，由水牛角、梔子、陳皮、赤芍、白花蛇舌草、半枝蓮等10味中藥組成，具有解毒、化瘀抗癌、扶正驅(qū)邪的功效，用于癌癥晚期止疼抑癌的治療。方中水牛角為君藥，梔子、陳皮、赤芍為臣藥。輔助君藥解毒，扶正抗癌。為了考察解毒抗癌巴布劑的釋放量及透皮率，本實(shí)驗(yàn)以解毒抗癌巴布劑處方中的梔子、陳皮、赤芍中活性成分為考察指標(biāo)，來研究解毒抗癌巴布劑的透皮性能，同時(shí)對解毒抗癌巴布劑給藥后的藥動學(xué)進(jìn)行研究[1]，為臨床治療提供理論及數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waterse2695高效液相色譜儀(美國，自動進(jìn)樣器，紫外檢測器：Waters2489)；BP211D電子天平(德國賽多利斯，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RYJ-6A型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器廠)；島津LC-16型色譜儀；艾柯超純水機(jī)(EXCEED 型，成都艾柯水處理有限公司)。

1.2試藥 梔子苷對照品(批號：749-201309，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；芍藥苷對照品(批號：110736-201438，中國食品藥品檢定研究院，含量≥99%)；橙皮苷(批號：110721-201211，中國食品藥品檢定研究院，含量≥99%)；甲醇為色譜純(國藥控股有限公司)，乙腈為色譜純(美國TEDLA公司)；超純水；自制解毒抗癌巴布劑(批號：18121500)。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雌性小鼠(6～8周)，體質(zhì)量(20±5) g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心動物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號：NO.4200695787，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0030。飼養(yǎng)環(huán)境：屏蔽環(huán)境，普通維持飼料，自由飲水，室溫(22±3) ℃，相對濕度(55±5)%，12 h光照黑暗循環(huán)。

2 條件與方法

2.1色譜條件 色譜柱為依利特Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL·min-1，流動相：乙腈(A)：0.2%磷酸(B)=15：85；檢測波長：250 nm，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品混合溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的梔子苷、芍藥苷、橙皮苷對照品適量至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別制成梔子苷、芍藥苷、橙皮苷濃度為202.8，173.4，225.2 μg·L-1對照品混合儲備液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2供試品溶液的制備 稱取適量的明膠，加水浸泡溶脹制成明膠膠體液，依次加入甘油、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、高嶺土，攪拌均勻制成粘性適中的基質(zhì)漿料，加入解毒抗癌巴布劑流浸膏，邊加邊攪拌，放置熟化，制成巴布劑膏體，調(diào)節(jié)好涂布規(guī)格，涂布、晾干(減壓干燥下抽干空氣和氣泡)，按規(guī)格切割成片。

取解毒抗癌巴布劑一貼(批號：18121501)，除去蓋襯，稱取藥膏約0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取(120 W，頻率42 kHz)30 min后靜置放冷，補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 分別取解毒抗癌巴布劑的缺梔子、赤芍、陳皮3味中藥，其余按比例稱取，制備成陰性巴布劑，按“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，分別制成缺梔子陰性樣品溶液、缺赤芍陰性樣品、缺陳皮陰性樣品和缺梔子、赤芍、陳皮樣品。

3 方法學(xué)考察

3.1專屬性考察 分別取“2.2”溶液制備的對照品混合溶液、供試品溶液，陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，并記錄色譜圖，見圖1。通過高效液相色譜圖可知，供試品溶液的3個目標(biāo)主峰保留時(shí)間分別與對照品溶液的主峰保留時(shí)間對應(yīng)一致且無干擾，陰性樣品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間位置無干擾峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

3.2線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下混合對照品儲備液，精密吸取對照品儲備液1，2，3，4，5，10 mL，分別置于50 mL量瓶中，各加入50%甲醇稀釋溶解，定容至刻度，分別制成梔子苷系列濃度為4.056，8.112，12.168，16.224，20.28，40.56 μg·L-1；芍藥苷系列濃度為3.468，6.936，10.404，13.872，17.34，34.68 μg·L-1；橙皮苷系列濃度為4.504，9.008，13.512，18.016，22.52，45.04 μg·L-1的系列對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，分別記錄梔子苷、芍藥苷、橙皮苷峰面積，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：梔子苷Y1=1.578×104X1-3.789×103(r=0.999 7)；芍藥苷Y2=8.79×105X2-1.764×103(r=0.999 6)；橙皮苷Y3=7.89×104X3-5.78×103(r=0.999 8)。結(jié)果表明，梔子苷在4.056～40.56 μg·L-1，芍藥苷在3.468～34.68 μg·L-1，橙皮苷在4.504～45.04 μg·L-1濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3精密度考察 取上述混合對照品儲備液，分別精密吸取5 mL，置于50 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋溶解，定容至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.74%；芍藥苷峰面積的RSD為0.98%；橙皮苷峰面積的RSD為0.83%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取解毒抗癌巴布劑(批號：18121501)，稱取約0.2 g，精密稱定，按上述“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備成供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，分別記錄峰面積，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD為1.22%(n=6)；芍藥苷峰面積的RSD為1.78%(n=6)；橙皮苷峰面積的RSD為1.09%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取解毒抗癌巴布劑(批號：1812-1501)的樣品，分別稱取6份，各約0.2 g，精密稱定，按上述“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算各組分的平均含量，結(jié)果梔子苷、芍藥苷和橙皮苷平均含量分別為1677，2104，3241.5 μg·g-1，分別計(jì)算RSD為1.23%(n=6)、1.78%(n=6)、1.95%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定解毒抗癌巴布劑(批號：18121501)已知含量的解毒抗癌巴布劑6份，各約0.1 g，精密稱定，分別加入適量梔子苷、芍藥苷、橙皮苷對照品，按上述“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。加樣回收率結(jié)果可知，計(jì)算RSD分別為1.49%，1.13%，1.58%，表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，方法可行。

1.梔子苷；2.芍藥苷；3.橙皮苷。

3.7樣品含量測定 取解毒抗癌巴布劑3批(批號：18121501、18121601、18121701)，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的含量，結(jié)果見表2。

4 釋放度實(shí)驗(yàn)

按2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)項(xiàng)下0931關(guān)于溶出度與釋放度測定法第四法槳碟法進(jìn)行操作。用不銹鋼篩網(wǎng)(孔徑2 mm×2 mm)做成網(wǎng)碟2個，精確稱取解毒抗癌巴布劑0.20 g，將其用網(wǎng)碟2個固定，同時(shí)使巴布劑藥面朝上，置于500 mL燒杯中部，加入37 ℃的0.9%氯化鈉溶液500 mL，保持恒溫，采用攪拌槳進(jìn)行勻速攪拌，分別10，30，60，90，120 min時(shí)精密吸取100 mL溶液，取樣后分別再注入恒溫0.9%氯化鈉溶液100 mL。

4.1供試品溶液的制備 將5個不同時(shí)間點(diǎn)取得釋放液，分別置于蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液即得。

4.2釋放度測定及結(jié)果 將上述不同時(shí)間點(diǎn)制備的供試品溶液，按照上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，計(jì)算釋放含量，結(jié)果梔子苷在10，30，60，90，120 min的累積釋放度分別為12.75%，39.27%，48.76%，67.84%，83.81%；芍藥苷的累積釋放度分別為14.36%，37.55%，52.10%，66.88%，84.17%；橙皮苷的累積釋放度分別為10.27%，36.74%，49.10%，58.22%，79.38%。

5 離體小鼠透皮率測定

取SPF級小鼠，脫頸處死，用8%硫化鈉溶液脫毛，用剪刀從腹部剝離整個皮膚，用0.9%氯化鈉溶液洗凈[2-3]，采用改良的Franz擴(kuò)散池，將鼠皮背部朝下，腹部皮膚朝上，固定于接收池上，稱取解毒抗癌巴布劑0.20 g，精密稱定，緊貼置于鼠皮膚處，接收池內(nèi)加滿0.9%氯化鈉溶液，水域恒溫保持在(37±1) ℃，開啟磁力攪拌(設(shè)置攪拌速度為200 r·min-1)，分別于2，4，6，8，10，12，24 h，取出接收池中的接收液，同時(shí)補(bǔ)充同量的恒溫0.9%氯化鈉溶液(37±1) ℃[2-9]。

5.1解毒抗癌巴布劑供試品溶液制備 分別將6次接收液分別水浴蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶液洗滌，置于1 mL量瓶中，并定容、搖勻，過微孔濾膜，即得。

表2 樣品含量測定結(jié)果

5.2離體透皮率含量測定 將上述供試品溶液分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣20 μL，檢測，分別計(jì)算供試品中梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的含量及經(jīng)皮滲透的動力學(xué)擬合，結(jié)果見表3，4。

5.3結(jié)果 由表4可知，解毒抗癌巴布劑中梔子苷動力學(xué)擬合方程中，擬合度最高為0.976，符合Higuchi方程；芍藥苷動力學(xué)方程中，擬合度最高為0.964，符合Higuchi方程；橙皮苷動力學(xué)方程中，擬合度最高為0.997，符合Higuchi方程。

由圖2結(jié)果可知，解毒抗癌巴布劑中離體小鼠透皮率，3個有效成分含量均為逐步緩慢釋放，表明該制劑為骨架型控釋制劑。

6 討論

解毒抗癌巴布劑處方中，方中水牛角為君藥，梔子、陳皮、赤芍為臣藥。輔助君藥解毒，扶正抗癌。其君藥水牛角無具體的含量測定指標(biāo)，故選擇臣藥梔子、陳皮、赤芍中的有效成分來考察解毒抗癌巴布劑的釋放量及透皮率，同時(shí)3個成分含量的測定可用于該制劑的質(zhì)量控制。

表3 梔子苷、芍藥苷、橙皮苷的離體透皮率測定結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.2%磷酸水等不同流動相系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)流動相選擇乙腈-0.2%磷酸水時(shí)，3個色譜峰可以達(dá)到基線分離，然后對其流動相比例進(jìn)行優(yōu)選，最終選擇乙腈-0.2%磷酸水=15：85，分離效果最好。

表4 經(jīng)皮滲透動力學(xué)擬合方程

圖2 解毒抗癌巴布劑中梔子苷、芍藥苷、橙子苷累積透皮量-時(shí)間變化曲線

通過紫外分光度計(jì)對混合對照品進(jìn)行全波長掃描，在250 nm處，3個有效成分有最大的紫外吸收，故本實(shí)驗(yàn)最終選擇吸收波長為250 nm。

緩釋制劑釋藥主要是溶出原理，擴(kuò)散原理及溶蝕與擴(kuò)散、溶出結(jié)合作用。骨架型主要有3種類型：溶蝕性骨架片，不溶性骨架片和親水性凝膠骨架片，釋藥機(jī)制各不相同。由不可溶解但可溶蝕的蠟質(zhì)材料制成的溶蝕性骨架片是通過孔道擴(kuò)散與蝕解控制藥物來釋放。不溶性骨架片的藥物釋放是液體穿透骨架，將藥物溶解然后從骨架的溝槽中擴(kuò)散出來，故孔道擴(kuò)散為限速步驟，釋放符合Higuchi方程。