紫杉醇耐藥細(xì)胞株SKOV3/TS的建立及多藥耐藥性比較

尹茳平,王 琪,張 瑋,黎丹戎,李 力*

0 引言

卵巢癌是我國(guó)致死率最高的婦科惡性腫瘤，初始治療以手術(shù)聯(lián)合化療為主，其中紫杉醇聯(lián)合鉑類(lèi)是最常用的一線(xiàn)化療方案之一[1]。紫杉醇成分復(fù)雜，其抗癌活性成分屬于四環(huán)二萜類(lèi)化合物，主要通過(guò)影響α、β微管蛋白的動(dòng)態(tài)平衡以及二聚體的形成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促其凋亡[2]。在長(zhǎng)期治療中，與其他化療藥物類(lèi)似，紫杉醇也會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[3]。深入探討卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥機(jī)制，對(duì)于提高紫杉醇的臨床應(yīng)用和療效具有十分重要的價(jià)值。目前基礎(chǔ)研究多選擇二維培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞模型，包括濃度梯度遞增法、間歇誘導(dǎo)法等[4]，但都存在一定的局限性。近年來(lái)，三維細(xì)胞模型培養(yǎng)備受關(guān)注[5]，本文擬通過(guò)二維和三維培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建不同的SKOV3紫杉醇耐藥細(xì)胞株，為建立理想的體外耐藥細(xì)胞模型提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 紫杉醇(TAX，規(guī)格：30 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H10980068，山東齊魯制藥廠)、奧沙利鉑[L-OHP，規(guī)格：50 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20093892，費(fèi)森尤斯卡比(武漢)醫(yī)藥有限公司]、吉西他濱(GCB，規(guī)格：200 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030104，江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、米托蒽醌(MIT，規(guī)格：5 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H10960189，四川升和藥業(yè)股份有限公司)、環(huán)磷酰胺(CTX，規(guī)格：200 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.1.3 主要試劑 Ⅰ型鼠尾型膠原和噻唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)Sigma公司；Ⅰ型膠原酶、RPMI1640培養(yǎng)液、特基胎牛血清和胰蛋白酶，美國(guó)Hyclone公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，大連寶生生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)，山東BIOBASE科學(xué)儀器有限公司；CKX41-A32PH型倒置相差顯微鏡，日本奧林巴斯；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單層(二維)細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存SKOV3細(xì)胞，室溫下復(fù)蘇后，加入RPMI1640完全培養(yǎng)液，置于無(wú)菌條件下的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合率超過(guò)70%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 濃度梯度遞增法建立SKOV3/TS-1耐藥細(xì)胞株 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。加入0.02 μg/ml紫杉醇溶液，48 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3周后，逐級(jí)遞增紫杉醇干預(yù)濃度，待SKOV3細(xì)胞可在0.1 μg/ml的含藥培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)，即得到SKOV3/TS-1耐藥細(xì)胞株。

1.2.3 三維細(xì)胞培養(yǎng) 采用Liquid Overlay技術(shù)，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3細(xì)胞，接種于含有膠原培養(yǎng)液(ddH2O∶PBS∶胎牛血清∶Ⅰ型鼠尾型膠原∶RPMI1640培養(yǎng)液=1∶1∶1∶2∶5，pH值7.0)的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5 h，待完全凝固成為細(xì)胞培養(yǎng)層后，加入RPMI1640培養(yǎng)液作為覆蓋層，隔日更換一次新鮮培養(yǎng)液。將得到的細(xì)胞命名為SKOV3/TS-2。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 利用倒置相差顯微鏡，觀察二維培養(yǎng)及三維培養(yǎng)條件下的SKOV3/TS-1和SKOV3/TS-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。

1.2.5 藥物敏感性測(cè)定 取二維培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞和SKOV3/TS-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml。以100 μl/孔接種于96孔板中，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待貼壁生長(zhǎng)后，更換含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。另取三維培養(yǎng)的SKOV3/TS-2細(xì)胞，以相同方式接種于含有膠原培養(yǎng)液的96孔板中，覆蓋層培養(yǎng)液中加入不同藥物干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，繪制抑制率曲線(xiàn)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(Resistance index，RI)。藥物濃度設(shè)定參考臨床用量的血藥峰濃度，上下浮動(dòng)55倍，見(jiàn)表1。

表1 交叉耐藥的藥物濃度設(shè)定

RI=IC50(SKOV3/TS)/IC50(SKOV3)

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)基因 收集SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1或SKOV3/TS-2細(xì)胞1×107個(gè)，加入TRIzol試劑提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min，最后80 ℃ 5 min。以cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，90 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參選擇β-actin。以2-△△CT法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。β-actin引物：上游引物5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；下游引物5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′。多藥耐藥基因1(Multidrug resistance 1，MDR1)引物：上游引物5′-GGA CTG AGC CTG GAG GTG AAG AA-3′；下游引物5′-CGC TCC TTG ACT CTG CCA TTC TG-3′。β-微管蛋白Ⅲ型(β-tubulin-III，TUBB3)引物：上游引物5′-CGC GGA TCC GCA GGA AAT TTA GAA GA-3′；下游引物5′-CCG GAA TTC TTA GGC ATA CCT GGT CAT GTC TCC-3′。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π(Glutathione s-transferase-π，GST-π)引物：上游引物5′-CCA ATA CCA TCC TGC GTC AC-3′；下游引物5′-TCA CTG TTT CCC GTT GCC CAT-3′。

2 結(jié)果

2.1 SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1細(xì)胞、SKOV3/TS-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，二維培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞和SKOV3/TS-1細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞體積較小，形態(tài)均勻一致。與SKOV3細(xì)胞相比，SKOV3/TS-1細(xì)胞大小、形狀不一，且細(xì)胞體積偏大，核分裂相增多。而三維培養(yǎng)的SKOV3/TS-2細(xì)胞呈圓形，懸浮于膠原培養(yǎng)液中聚團(tuán)生長(zhǎng)，多細(xì)胞球大小不一、形狀不規(guī)則。見(jiàn)圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞(A)、SKOV3/TS-1細(xì)胞(B)、SKOV3/TS-2細(xì)胞(C)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

2.2 SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1細(xì)胞、SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)TAX敏感性檢測(cè) 經(jīng)MTT法檢測(cè)，SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1細(xì)胞、SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)TAX藥物的IC50為(0.240±0.078)μg/ml、(4.285±0.538)μg/ml、(3.540±0.356)μg/ml，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞RI分別為17.85和14.75。見(jiàn)圖2、表2。

表2 其他化療藥物對(duì)SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞增殖抑制的IC50

2.3 SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)其他化療藥物交叉耐藥性檢測(cè) 經(jīng)MTT法檢測(cè)，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)CTX、L-OHP、GCB、MIT均有一定的耐藥性，且SKOV3/TS-2細(xì)胞的耐藥性高于SKOV3/TS-1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同化療藥物干預(yù)條件下SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1細(xì)胞、SKOV3/TS-2細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

2.4 SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)變化 經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞TUBB3mRNA和MDR1mRNA表達(dá)量高于SKOV3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而3種細(xì)胞GST-π mRNA表達(dá)基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)差異

圖2 不同TAX干預(yù)條件下SKOV3細(xì)胞、SKOV3/TS-1細(xì)胞、SKOV3/TS-2細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

3 討論

紫杉醇是卵巢癌一線(xiàn)化療藥物之一[6]，但是耐藥性問(wèn)題一直是困擾臨床的重要難題。耐藥細(xì)胞株模型的建立，對(duì)于深入闡述腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性以及提高臨床化療效果有重要價(jià)值。既往的基礎(chǔ)研究中最常采用的耐藥細(xì)胞株都屬于單層貼壁(二維)培養(yǎng)系統(tǒng)，包括高濃度間歇誘導(dǎo)法[7]、藥物濃度遞增誘導(dǎo)法[8]、高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)與藥物濃度遞增相結(jié)合法[9]等，一方面由于操作步驟繁瑣、藥物劑量不好把握、培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)等，另一方面不能完全模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，因此耐藥性有限，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在一定的局限性。

注：*與SKOV3細(xì)胞相比，P<0.05；#與SKOV3/TS-1細(xì)胞相比，P<0.05

注：*與SKOV3細(xì)胞相比，P<0.05

三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是近年新發(fā)展的一項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，利用具有三維結(jié)構(gòu)的支架材料作為載體[10]，例如本研究中所使用的Ⅰ型鼠尾型膠原，此外還包括瓊脂糖、Matrigel、殼聚糖、明膠等，與細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞-細(xì)胞-載體三維空間結(jié)構(gòu)，既能保留天然細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),又能更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境[11]，因此，三維培養(yǎng)系統(tǒng)得到的細(xì)胞更貼近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，對(duì)于耐藥機(jī)制的研究更具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

本研究分別通過(guò)二維培養(yǎng)系統(tǒng)和濃度梯度遞增法建立TAX耐藥細(xì)胞株SKOV3/TS-1，通過(guò)三維培養(yǎng)系統(tǒng)建立SKOV3/TS-1細(xì)胞株，通過(guò)MTT法驗(yàn)證，兩種細(xì)胞模型對(duì)TAX均具有顯著耐藥性，RI分別為17.85和14.75。說(shuō)明SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)TAX的敏感性均低于親本細(xì)胞SKOV3，但是單純從耐藥指數(shù)分析，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)TAX的耐藥性差別不明顯。另外，通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)SKOV3/TS-1細(xì)胞具有明顯的伸展性，且細(xì)胞體積和形態(tài)較為均一；而SKOV3/TS-2細(xì)胞則懸浮于三維支架載體中，大多呈抱團(tuán)生長(zhǎng)，細(xì)胞間連接更為緊密，含有豐富的胞間連接、中間連接、橋粒等結(jié)締組織[12]，這可能也是導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的重要原因之一。而且考慮到二維培養(yǎng)的SKOV3/TS-2腫瘤細(xì)胞雖然增殖迅速，但短期內(nèi)易退化死亡，而SKOV3/TS-1細(xì)胞不易過(guò)度生長(zhǎng)，說(shuō)明三維培養(yǎng)環(huán)境可以為腫瘤細(xì)胞提供更大的生長(zhǎng)空間。

此外，本研究進(jìn)一步觀察SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)其他化療藥物的交叉耐藥性，結(jié)果顯示，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞對(duì)CTX、L-OHP、GCB、MIT均有一定的耐藥性，且SKOV3/TS-2細(xì)胞的耐藥性高于SKOV3/TS-1細(xì)胞。推測(cè)可能是由于三維培養(yǎng)系統(tǒng)得到的SKOV3/TS-2細(xì)胞的生長(zhǎng)周期多停滯在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞分裂增殖活躍度顯著降低，早期凋亡率大大增加；同時(shí)腫瘤細(xì)胞也喪失了大量化療藥物作用靶點(diǎn)，使得細(xì)胞向耐藥表型轉(zhuǎn)化[13]。在本研究中，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞TUBB3 mRNA和MDR1 mRNA表達(dá)量均高于SKOV3細(xì)胞。P-糖蛋白(Permeability glycoprotein，P-gp)是一類(lèi)跨膜糖蛋白分子，因其可以利用ATP水解釋放的能量促使眾多化療藥物排出細(xì)胞外，因此是目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可的多藥耐藥分子之一，被認(rèn)為是MDR1基因編碼的能量依賴(lài)型藥泵[14]。而TUBB3是影響α、β微管蛋白動(dòng)態(tài)平衡、微管二聚體重聚的重要分子[15]。在本研究中SKOV3-TS細(xì)胞TUBB3 mRNA表達(dá)量升高，說(shuō)明微管蛋白的動(dòng)力學(xué)活性最高，從而逆轉(zhuǎn)了TAX抑制微管聚合的作用，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TAX產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，三維培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建的SKOV3/TS-2細(xì)胞模型與二維培養(yǎng)系統(tǒng)得到的SKOV3/TS-1細(xì)胞相比，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性都顯示了較大差異，這可能是誘導(dǎo)SKOV3/TS-2細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)多藥耐藥的作用機(jī)制之一。此外，SKOV3/TS-1細(xì)胞和SKOV3/TS-2細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)基因TUBB3mRNA和MDR1mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，這可能與細(xì)胞產(chǎn)生交叉耐藥有關(guān)，但其相關(guān)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。