丹參酮ⅡA通過(guò)激活SDF-1/CXCR4軸對(duì)大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用

唐志愛(ài)，郭世燕，黃建波

0 引言

急性心肌梗死是指冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞生因子-1(Stromal cell-derived factor-l，SDF-l)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)軸的變化在心肌梗死的疾病進(jìn)展和預(yù)后中起著重要作用[1-4]。SDF-1/CXCR4軸廣泛表達(dá)于機(jī)體的多種組織細(xì)胞中，且與血管生成、成骨分化、胚胎發(fā)育、神經(jīng)修復(fù)等多種生理功能密切相關(guān)[5-8]。丹參酮ⅡA是從傳統(tǒng)中藥材丹參的干燥根及根莖中提取得到的一種單體化合物。研究表明，丹參酮ⅡA具有心臟保護(hù)作用及血管修復(fù)作用[9-12]，而丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸對(duì)急性心肌梗死大鼠的保護(hù)作用目前尚不明確。本文通過(guò)研究丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠的保護(hù)作用及對(duì)SDF-1/CXCR4軸的影響，為急性心肌梗死的臨床治療提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，SPF(Specific Pathogen Free)級(jí)別，6周齡，體重(180±20)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物房溫度(22±2)℃，濕度(50%±10%)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀購(gòu)自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自北京島津公司。丹參酮ⅡA購(gòu)自西寶生物科技(上海)股份有限公司，SDF-1、CXCR4和GAPDH抗體均購(gòu)自Proteintech公司，RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RIPA蛋白裂解液、TNF-α、IL-6及IL-1β檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，ECL顯色液購(gòu)自Thermo公司。

1.2 急性心肌梗死大鼠模型的建立及給藥 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為對(duì)照組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組。模型組及丹參酮ⅡA低、中、高劑量組參照文獻(xiàn)方法建立急性心肌梗死大鼠模型[13-14]。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射(0.3～0.35 ml/100 g)麻醉，麻醉滿意后置于手術(shù)臺(tái)，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖后，經(jīng)口氣管插管同時(shí)用小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，沿肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開(kāi)皮膚，逐層分離皮下組織、肌肉，于2～3肋間撐開(kāi)進(jìn)胸，向右上方推開(kāi)胸腺，暴露心臟及大血管根部，切開(kāi)心包，輕擠大鼠胸廓，將心臟擠出，用可吸收縫合線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈血管縫針，進(jìn)針深度控制在0.1 cm，寬度為0.1～0.2 cm。以心電圖出現(xiàn)病理性Q波判斷為急性心肌梗死，若無(wú)病理性Q波，則再次結(jié)扎，以提高大鼠心肌梗死模型成功率，然后逐層縫合心腔。對(duì)照組僅開(kāi)胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。所有大鼠腹腔注射青霉素，8萬(wàn)U/只，連續(xù)3 d預(yù)防感染。造模完成后，丹參酮ⅡA低、中、高劑量組根據(jù)大鼠體重，按20 ml/kg分別灌胃給予大鼠1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的丹參酮ⅡA[15-16]，對(duì)照組及模型組20 ml/kg灌胃給予生理鹽水，每日定時(shí)給藥1次，連續(xù)給藥21 d，最后一次給藥24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平測(cè)定 所有大鼠最后一次給藥24 h后，通過(guò)眼眶后靜脈叢取血至肝素潤(rùn)洗過(guò)的離心管中，4 ℃靜置4 h，然后置于離心機(jī)中，4 ℃、3 500 r/min離心10 min。取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血漿中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 按照0.3～0.35 ml/100 g對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，將壓力容積導(dǎo)管經(jīng)左頸動(dòng)脈插入大鼠的左心室(Left ventricle，LV)腔內(nèi)，接入壓力換能器，應(yīng)用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄LV舒張末期容積(End-diastolic volume，EDV)、收縮末期容積(End-systolic volume，ESV)，并按照以下公式計(jì)算大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(Left Ventricle Ejection Fractions，LVEF)。

1.5 大鼠心肌組織樣本采集及組織蛋白的提取 斷頭處死后迅速分離大鼠心臟，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈表面血液，用濾紙吸干表面水分后，然后將一部分心肌組織放入10%中性甲醛中固定，一部分用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用RNA提取試劑盒分別提取各組大鼠心肌組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心肌組織中β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA的表達(dá)。各檢測(cè)基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物見(jiàn)表1，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的基因引物序列

1.7 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 將在10%中性甲醛中固定24 h后的心肌組織轉(zhuǎn)移至75%酒精中，經(jīng)自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、透明處理，在石蠟包埋機(jī)中浸蠟、包埋，進(jìn)行5 μm切片，水浴展開(kāi)，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；②復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次,然后把水吸干；③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來(lái)水流水沖洗2 min，把水吸干；④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，吸干水；⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min；⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min；⑦封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹(shù)膠封片。

1.8 Western blot 將凍存的心肌組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，處理好待測(cè)樣品后，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)SDF-1、CXCR4及GAPDH抗體(1∶1 000)孵育后，4 ℃過(guò)夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥因子水平的影響 大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平見(jiàn)表2。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組心肌梗死大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著升高(P<0.05)，提示心肌梗死的發(fā)病機(jī)制與大鼠體內(nèi)炎癥因子水平的變化密切相關(guān)；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著丹參酮ⅡA劑量的增加，大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐漸降低，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴(lài)性地顯著降低急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥因子水平，改善急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài)，緩解心肌梗死大鼠疾病進(jìn)展。

表2 各組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較(n=6)

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠LVEDV、LVESV均顯著升高(P<0.05)，LVEF顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠LVEDV、LVESV均顯著降低(P<0.05)，LVEF顯著升高(P<0.05)，且表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴(lài)性地改善急性心肌梗死大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化，降低心臟前后負(fù)荷，改善心肌梗死大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)，緩解大鼠疾病進(jìn)展，改善心肌梗死大鼠疾病轉(zhuǎn)歸。

表3 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較(n=6)

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平的影響 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平見(jiàn)表4。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，提示大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平變化與急性心肌梗死發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組心肌梗死大鼠心肌組織Bax、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，且表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，提示丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴(lài)性地抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的進(jìn)一步壞死，改善大鼠疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3 mRNA水平比較(n=6)

2.4 組織病理學(xué)檢查 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組急性心肌梗死大鼠心肌組織細(xì)胞廣泛性壞死，可見(jiàn)炎性浸潤(rùn)，提示造模成功；與模型組相比，丹參酮ⅡA低、中劑量組大鼠心肌組織炎性浸潤(rùn)明顯減輕，心肌壞死細(xì)胞脫落減少，丹參酮ⅡA高劑量組大鼠心肌組織偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落，肌纖維清晰，提示丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠心肌組織病理學(xué)改變，降低心肌組織炎癥水平，修復(fù)受損心肌肌纖維，恢復(fù)大鼠心肌組織細(xì)胞功能，緩解心肌梗死大鼠疾病進(jìn)展，改善疾病預(yù)后。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查(40×)注：A.對(duì)照組,B.模型組,C.丹參酮ⅡA低劑量組,D.丹參酮ⅡA中劑量組,E.丹參酮ⅡA高劑量組

2.5 丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平的影響 各組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著降低(P<0.05)，提示急性心肌梗死能夠抑制大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸相關(guān)蛋白的表達(dá)；與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著升高(P<0.05)，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性，提示丹參酮ⅡA能夠通過(guò)激活急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸，促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善急性心肌梗死大鼠的疾病狀態(tài)及進(jìn)展。

圖2 各組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平

3 討論

急性心肌梗死是指冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，通常多為在冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛及內(nèi)皮損傷基礎(chǔ)上繼發(fā)血栓形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)、完全閉塞，血供急劇減少或中斷，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、損傷和壞死過(guò)程的臨床綜合征。研究表明，心肌梗死的發(fā)生可以影響心肌組織SDF-1/CXCR4軸及相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而引起壞死心肌組織進(jìn)一步惡化，加重心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，嚴(yán)重影響疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后[1-4]。

SDF-1/CXCR4軸廣泛表達(dá)于機(jī)體的多種組織細(xì)胞中，且與血管生成、成骨分化、胚胎發(fā)育、神經(jīng)修復(fù)等多種生理功能密切相關(guān)。SDF-1/CXCR4軸參與調(diào)控BMSCs定向分化，修復(fù)大鼠急性脊髓損傷，并參與調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化，修復(fù)缺氧缺血性腦損傷，在心肌梗死大鼠心肌組織中，SDF-1/CXCR4軸及相關(guān)蛋白表達(dá)會(huì)發(fā)生波動(dòng)性變化，且可能與心肌梗死的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[5-8]。

TNF-α、IL-6及IL-1β是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥標(biāo)志物，當(dāng)心肌梗死發(fā)生時(shí)，這些炎癥因子水平能夠間接反映心肌細(xì)胞的炎癥狀態(tài)。Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，其表達(dá)水平可以間接反映細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。有研究表明，SDF-1/CXCR4軸的激活能夠抑制體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β等炎癥因子的釋放，并阻止炎癥因子與受損組織相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)抑制細(xì)胞促凋亡基因Bax、Caspase-12和Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，緩解組織損傷，加速組織自我修復(fù)[4-6]。

丹參酮ⅡA是從傳統(tǒng)中藥材丹參的干燥根及根莖中提取得到的一種單體化合物。近年研究表明，丹參酮ⅡA能夠改善冠狀動(dòng)脈血循環(huán)，修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，抗心肌肥厚，防止糖尿病并發(fā)癥等。丹參酮ⅡA具有止痛、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、血管內(nèi)皮修復(fù)等多種藥理作用。研究表明，丹參酮ⅡA能夠調(diào)控外周血中SDF-1/CXCR4軸，影響2型糖尿病患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后[9-12]。而丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸對(duì)急性心肌梗死大鼠的作用及機(jī)制目前尚不明確。

本文采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈血管的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，研究不同劑量的丹參酮ⅡA對(duì)急性心肌梗死大鼠的作用及機(jī)制。結(jié)果顯示，與模型組相比，丹參酮ⅡA各劑量組急性心肌梗死大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及心肌組織Bax、Caspase-12、Caspase-3 mRNA水平均顯著降低，Bcl-2水平顯著升高，LVEDV、LVESV均顯著降低，LVEF顯著升高。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴(lài)性地顯著降低急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥因子水平，改善急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài)；改善急性心肌梗死大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化，降低心臟前后負(fù)荷，改善心肌梗死大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)，緩解大鼠疾病進(jìn)展，改善心肌梗死大鼠疾病轉(zhuǎn)歸；同時(shí)能夠呈劑量依賴(lài)性地抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的進(jìn)一步壞死。組織病理學(xué)檢查表明，丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠組織病理學(xué)變化，提示丹參酮ⅡA能夠顯著改善急性心肌梗死大鼠心肌組織病理學(xué)改變，降低心肌組織炎癥水平，修復(fù)受損心肌肌纖維，恢復(fù)大鼠心肌組織細(xì)胞功能，緩解心肌梗死大鼠疾病進(jìn)展，改善疾病預(yù)后，Western blot結(jié)果表明，丹參酮ⅡA各劑量組大鼠心肌組織SDF-1、CXCR4水平顯著升高，提示丹參酮ⅡA能夠通過(guò)激活急性心肌梗死大鼠心肌組織SDF-1/CXCR4軸，促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善急性心肌梗死大鼠的疾病狀態(tài)及進(jìn)展。

綜上所述，丹參酮ⅡA能夠抑制急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)急性心肌梗死大鼠的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活急性心肌梗死大鼠體內(nèi)SDF-1/CXCR4軸有關(guān)。