黑果腺肋花楸提取物的急性毒性和致突變性研究

黃超培，覃輝艷，張陸娟，王彥武，何 勵(lì)，傅偉忠

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530028)

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa) 是一種薔薇科灌木，因具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，二十多年前從國(guó)外陸續(xù)引進(jìn)我國(guó)種植，其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和生物活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、消炎、抗菌等功效[1-2]，已被用于食品、保健品、化妝品等產(chǎn)品[3-4]，具有很好的應(yīng)用前景。近年來，對(duì)黑果腺肋花楸果提取物的成分及活性物的功效作用研究比較多，而對(duì)它的毒性方面則少見報(bào)道，本文依據(jù)食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法對(duì)其進(jìn)行急性毒性及致突變性研究，為對(duì)黑果腺肋花楸提取物的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)及后期的相關(guān)產(chǎn)品研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

黑果腺肋花楸果提取物溶液，其主要功效成分為原花青素(含量為2.79%)，擬用于功能性保健食品，由山西某科技公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級(jí)健康成年昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(桂)2014-0002，質(zhì)量合格證號(hào)45000300000854、4500030 0000864。動(dòng)物飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，質(zhì)量合格證編號(hào)44200300016584。動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)SYXK(桂)2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為55%～70%。

1.3 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株，購(gòu)于美國(guó)MOLTOX公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法[5]

1.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用最大耐受量試驗(yàn)法，選取體質(zhì)量為18～22 g 的昆明種成年小鼠20 只，雌、雄性各10只，試驗(yàn)前禁食16 h，不限飲水。采用最大給藥量法，按0.02 mL/g 給小鼠灌胃黑果腺肋花楸果提取物溶液1次，濃度為20 mg/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，灌胃后觀察、記錄小鼠的中毒表現(xiàn)，觀察14 d，以半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)評(píng)價(jià)受試物的急性毒性強(qiáng)弱。

1.4.2 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 四種試驗(yàn)菌株，設(shè)8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽性誘變劑對(duì)照。自發(fā)回變對(duì)照不加受試物，其余條件相同。采用平板摻入法，將試驗(yàn)菌株增菌液0.1 mL、受試溶液0.1 mL，代謝活化組再加入10% S9混合液0.5 mL，依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基試管內(nèi)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，迅速均勻鋪開。每個(gè)濃度組的每種菌株做3 個(gè)平行皿，在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿的回變菌落數(shù)，計(jì)算各濃度組平均回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(mutaion ratio，MR)，以MR＞2 且存在濃度-反應(yīng)關(guān)系者為陽性結(jié)果。重復(fù)試驗(yàn)1次。

1.4.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)設(shè)2.5、5、10 g/kg 3 個(gè)濃度組， 同時(shí)設(shè)陰性( 溶劑) 對(duì)照和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)陽性對(duì)照，每組10 只25～30 g 的昆明種成年小鼠，雌、雄性各5 只。按0.02 mL/g給小鼠灌胃受試物2 次(間隔24 h)，于末次給受試物后6 h 處死小鼠，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa 染色，在油鏡下觀察每只小鼠的1 000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)數(shù)含微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核細(xì)胞率。同時(shí)計(jì)數(shù)200 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值(PCE/NCE)。

1.4.4 精子畸形試驗(yàn)劑量及對(duì)照組設(shè)計(jì)同1.4.3項(xiàng)，每組10只25～35 g的昆明種成年雄性小鼠，每天灌胃給受試物1 次，連續(xù)5 d，于末次給受試物后第30天處死動(dòng)物，解剖取出兩側(cè)附睪，置生理鹽水中輕輕將其撕裂、搖晃，過濾取精子制片，伊紅染色，在高倍鏡下觀察每只小鼠的1 000 個(gè)完整精子，計(jì)算精子畸形率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量、菌落數(shù)、微核細(xì)胞率、PCE/NCE及精子畸形率等指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果以xˉ±s表示。骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)各組間的微核細(xì)胞率的均數(shù)比較采用Poisson分布的近似正態(tài)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，精子畸形試驗(yàn)各組間的精子畸形率的均數(shù)比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

給予黑果腺肋花楸提取物溶液14 d內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒體征和死亡，小鼠的進(jìn)食和飲水未見異常，小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)未受到明顯影響，見表1。觀察期結(jié)束解剖小鼠，肉眼觀察心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、睪丸、卵巢及胃腸等主要器官組織未見異常。由此可見，該受試物對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg。

表1 黑果腺肋花楸提取物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(n=10)

表2 黑果腺肋花楸提取物細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果

2.2 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果見表2，在加入或不加入S9代謝活化系統(tǒng)，黑果腺肋花楸提取物各濃度組和陰性對(duì)照的4 種試驗(yàn)菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)相接近，MR 值均小于2，且不存在濃度-反應(yīng)關(guān)系，而各陽性對(duì)照物均可誘發(fā)測(cè)試菌株的回復(fù)突變菌數(shù)明顯增高，MR 值2.99～133.64，表明該受試物未呈現(xiàn)誘發(fā)測(cè)試菌株的回復(fù)突變效應(yīng)。重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)的結(jié)果見表3，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的微核率及PCE/NCE值與陰性對(duì)照組接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各劑量組的PCE/NCE值均不少于陰性對(duì)照組的20%，而CTX陽性對(duì)照組的微核率則顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞有損傷和抑制作用。

表3 黑果腺肋花楸提取物對(duì)小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響(n=10#)

2.4 精子畸形試驗(yàn)

精子畸形試驗(yàn)的結(jié)果見表4，黑果腺肋花楸提取物各劑量組的精子畸形率與陰性對(duì)照組接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而CTX 陽性對(duì)照組的精子畸形率則顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，提示未見該受試物對(duì)雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。

表4 黑果腺肋花楸提取物對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響(n=10)

3 討 論

黑果腺肋花楸被引進(jìn)我國(guó)種植的時(shí)間不長(zhǎng)，迄今未見有中毒報(bào)道，現(xiàn)有文獻(xiàn)尚無黑果腺肋花楸果實(shí)、果汁和提取物的任何有害和毒性作用的數(shù)據(jù)[6]。但是黑果腺肋花楸提取物是用化學(xué)溶劑乙醇(70%濃度)進(jìn)行提取，再經(jīng)過濾、濃縮和干燥獲得的，除了含原花青素外，還含有多酚、黃酮等多種成分，在進(jìn)行生產(chǎn)和推向市場(chǎng)之前，為了安全起見，對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)是必要的。

本研究檢測(cè)黑果腺肋花楸提取物的急性毒性，并聯(lián)合體外細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)與哺乳動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)，分別檢測(cè)基因水平、體細(xì)胞染色體及生殖細(xì)胞基因的損傷作用，對(duì)其潛在的致突變性進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果，在給予黑果腺肋花楸提取物后，小鼠未出現(xiàn)中毒體征和死亡，急性經(jīng)口毒性LD50大于20 g/kg(原花青素的濃度為558 mg/kg)，按照我國(guó)的食品急性毒性(LD50)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，該提取物的急性經(jīng)口毒性屬于無毒級(jí)；在體外細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，加入和不加入S9代謝活化系統(tǒng)兩種條件下，黑果腺肋花楸提取物8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5個(gè)濃度組的4 種試驗(yàn)菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變的菌落數(shù)相接近，MR值均小于2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，黑果腺肋花楸提取物2.5、5、10 g/kg 3 個(gè)濃度組的微核率、PCE/NCE 值和精子畸形率，與陰性對(duì)照組比較均無顯著性差異，表明未對(duì)小鼠的骨髓細(xì)胞有損傷和抑制作用，也未對(duì)雄性小鼠的精子產(chǎn)生畸變作用。從以上結(jié)果來看，未發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸提取物有急性毒性和致突變性作用，初步認(rèn)為黑果腺肋花楸提取物具有一定的安全性，可以開展后續(xù)的毒理學(xué)試驗(yàn)以便對(duì)其進(jìn)行更全面的安全性評(píng)價(jià)。但是，本研究只進(jìn)行了體外細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)和選用了一種嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，未選用非嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)僅用成年動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，未能反映年幼和老年動(dòng)物的體內(nèi)反應(yīng)，這樣得到的研究結(jié)果有一定的局限性，有待進(jìn)一步深入研究。