mTOR抑制劑AZD2014對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制研究

林凱煌，蔡高陽，劉新城

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東 汕頭 515065；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 汕頭 515065)

肝細(xì)胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率和病死率均有升高的趨勢[1]。對于早期肝癌患者來說，最有效的治療方式包括腫瘤局部消融、手術(shù)切除和肝臟移植治療；但對于中晚期肝癌患者，研究者們卻尚未找到合適的治療方法[2-4]。近年來，分子靶向藥物治療的出現(xiàn)給中晚期肝癌患者帶來了新希望[5]，科學(xué)家們把可以同時阻斷mTORC1 和mTORC2信號的哺乳動物雷帕鳴靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑稱為雙mTOR 抑制劑，目前比較常見的雙mTOR 抑制劑有PP244、AZD8055 及AZD2014 等，有研究表明，雙mTOR 抑制劑AZD2014有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、細(xì)胞周期阻滯和自噬，且可抑制腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)進(jìn)程[6-7]。然而截至目前，AZD2014的作用靶點(diǎn)尚不清楚。有研究表明，腫瘤細(xì)胞中含植物同源結(jié)構(gòu)和環(huán)指域泛素樣蛋白1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)的表達(dá)可被mTOR 抑制劑Torin-2顯著抑制[8]，這表明UHRF1可能是mTOR 抑制劑Torin-2發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物靶點(diǎn)。我們的前期研究表明，mTOR 抑制劑AZD2014 具有明顯的抗腫瘤作用[6]。為進(jìn)一步確定UHRF1 是否為mTOR 通路抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物靶點(diǎn)。我們用不同濃度的AZD2014 來處理人肝癌細(xì)胞HCCLM3，并檢測AZD2014對肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞中UHRF1表達(dá)水平的影響，進(jìn)而探討AZD2014在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 受試物

HCCLM3 細(xì)胞購于復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所；AZD2014 購于美國Selleckchem 公司；Trizol、逆 轉(zhuǎn) 錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑盒均購于日本TaKaRa 公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；UHRF1抗體購于美國Abcam公司。

1.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況

將適量狀態(tài)良好的HCCLM3 細(xì)胞接種于96 孔板中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至底面覆蓋率為30%～40%時分別加入完全培養(yǎng)基和不同濃度的受試物，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組，陰性對照組，AZD2014 10、100、500、1 000 nmol/L 組。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別于加入受試物后0、24、48、72及96 h按操作說明向各細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入適量CCK-8 溶液，37 ℃條件下孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀測定不同時間點(diǎn)各細(xì)胞培養(yǎng)孔在450 nm處的吸光度D(450)，并以此繪制各組細(xì)胞的增殖曲線。

1.3 熒光定量PCR 檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1 mRNA的表達(dá)

HCCLM3細(xì)胞經(jīng)不同濃度AZD2014處理96 h后棄去舊培養(yǎng)基，冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，再向各培養(yǎng)孔中加入適量Trizol，輕輕搖動培養(yǎng)板，使細(xì)胞裂解液流遍所有細(xì)胞表面，反復(fù)吹打使其充分裂解成勻漿，加入氯仿，離心后取上清，再加入異丙醇，離心后用75%乙醇洗脫，風(fēng)干后用滅菌用水溶解，測定RNA濃度后取適量RNA按說明配制反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再取適量反應(yīng)產(chǎn)物按熒光定量PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系并進(jìn)行反應(yīng)(引物序列見表1)，根據(jù)每個樣品不同復(fù)孔的CT值計(jì)算各組平均CT值及△CT值(△CT=CT，UHRF1-CT，GAPDH)，并由此計(jì)算出2-ΔΔCT值。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 Western blot檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1蛋白的表達(dá)

HCCLM3細(xì)胞經(jīng)不同濃度AZD2014處理96 h后用RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑PMSF 提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，裂解并煮沸變性后，取適量蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉非特異性抗體，再加上合適濃度的UHRF1 抗體，4 ℃孵育過夜；次日洗凈UHRF1 抗體后加上HRP 耦聯(lián)的二抗，搖床上室溫孵育1 h，洗凈后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測、圖像采集，之后再根據(jù)ImageJ軟件計(jì)算出的各蛋白條帶的相對灰度值來計(jì)算蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AZD2014對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10、100、500、1 000 nmol/L 的AZD2014 均可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，抑制作用程度與其濃度呈正相關(guān)(P＜0.05)，且AZD2014 在濃度為500 和1 000 nmol/L 時對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(P＜0.05，圖1)。

圖1 不同濃度AZD2014對肝癌HCCLM3細(xì)胞增殖的影響

2.2 AZD2014 對肝癌細(xì)胞中UHRF1 mRNA 表達(dá)的影響

實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)果見圖2，與空白對照或陰性對照組相比，可見HCCLM3 細(xì)胞中UHRF1 mRNA 的表達(dá)水平在經(jīng)500 和1 000 nmol/L AZD2014處理后顯著下降(P＜0.05)，且濃度為1 000 nmol/L 時最明顯，但10 和100 mmol/L 濃度的AZD2014 對HCCLM3 細(xì)胞中UHRF1 mRNA 的表達(dá)水平無明顯影響。據(jù)此我們初步認(rèn)為，UHRF1可能是mTOR抑制劑AZD2014發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物靶點(diǎn)。

圖2 不同濃度AZD2014對肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1 mRNA表達(dá)的影響

2.3 AZD2014對肝癌細(xì)胞中UHRF1蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測結(jié)果見圖3，與空白對照或陰性對照組相比，可見HCCLM3細(xì)胞中UHRF1蛋白的表達(dá)水平在經(jīng)500和1 000 mmol/L AZD2014處理后顯著下降，且濃度為1 000 mmol/L 時最明顯，但10 和100 mmol/L 濃 度的AZD2014 對HCCLM3 細(xì)胞中UHRF1 蛋白的表達(dá)水平無明顯影響，這和上述mRNA 表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。這更加進(jìn)一步證明，mTOR 抑制劑AZD2014可能是通過降低肝癌細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

圖3 不同濃度AZD2014對肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

mTOR 在體內(nèi)主要以mTORC1 和mTORC2 兩種形式存在，與腫瘤細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]?；罨膍TORC1使4EBP1和S6K發(fā)生磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而提高細(xì)胞的增殖能力[11]；mTORC2 則可活化AKT 信號通路，參與細(xì)胞內(nèi)多種生理過程[12]。然而，mTOR 信號通路異常激活阻礙細(xì)胞的分化，激發(fā)腫瘤的生成，加重腫瘤的惡化程度[13]。有研究表明，約一半的肝細(xì)胞癌患者存在mTOR 信號通路異常激活[14]。因此，針對mTOR 相關(guān)信號通路的藥物研究對肝細(xì)胞癌的治療具有重要意義。既往研究表明，mTOR 抑制劑除了本身具有抗腫瘤作用，還能使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物更敏感[15-16]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)AZD2014是一種較好的mTOR 抑制劑，它不僅能較完全地阻斷mTORC1信號，還能阻斷mTORC2 信號，具有理想的抗腫瘤作用[6]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，UHRF1可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，但其具體作用機(jī)制尚不明確。

UHRF1是近年來發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的核蛋白基因[17]，它通過與體內(nèi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白去乙?；傅认嗷プ饔?，參與調(diào)節(jié)DNA甲基化及染色質(zhì)修飾等基因表達(dá)調(diào)控[18]，并調(diào)控體內(nèi)抑癌基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的進(jìn)展[19]。我們既往的研究表明，UHRF1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平與肝癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，此外，敲低細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)不僅可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及EMT 進(jìn)程，還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯[20]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)AZD2014處理后，肝癌HCCLM3細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，且AZD2014濃度越高，肝癌細(xì)胞增殖能力被抑制得更明顯；同時我們還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AZD2014處理后肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1的表達(dá)水平顯著下降，因此，我們認(rèn)為，mTOR 抑制劑AZD2014 可能是通過降低肝癌細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的。當(dāng)然，本研究仍存在一些不足，如未通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證AZD2014是通過何種途徑來影響UHRF1的表達(dá)等，仍需繼續(xù)深入研究。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，AZD2014可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，且可顯著降低肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1的表達(dá)水平，因此我們認(rèn)為，AZD2014可能是通過抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)UHRF1的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的。