電子線照射對小鼠胰島素生長因子相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

袁 慧，劉夢雅，許文黎，胡 波，張亞娟，尹晶晶，岳 娟，李建國

(中國輻射防護(hù)研究院藥物安全性評價中心，山西 太原 030006)

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)是一類結(jié)構(gòu)與胰島素相似的多肽，主要包括IGF-1 和IGF-2 兩類多肽類生長因子，以及其相應(yīng)受體IGF-1R、IGF-2R 和至少6 種胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)。IGF 在各臟器中起著重要的代謝作用，控制各種細(xì)胞的增生、分化和凋亡進(jìn)程。由于IGF 在人體生命活動中承擔(dān)著重要作用，所以電離輻射后它的表達(dá)變化顯得尤為重要[1-5]。前期本課題組已經(jīng)得出輻射后IGF基因表達(dá)的變化情況[6-8]，本文將從蛋白水平上研究照射后小鼠體內(nèi)胰島素生長因子表達(dá)的變化。

本實驗采用Western blot 方法檢測電子線照射小鼠后，小鼠肝臟中IGF1、IGF-1R、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達(dá)情況，為之后探討電離輻射對IGF 的影響及其機(jī)制提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級BALB/c 雄性小鼠100 只，25～30 g，由中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2014-013；中國輻射防護(hù)研究院GLP中心動物實驗室飼養(yǎng)管理，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.2 輻照源

電子線采用直線加速器6 MeV 照射，Elekta Synergy，英國Elekta Limited 公司生產(chǎn)，山西白求恩醫(yī)院放療科提供，源皮距為100 cm，劑量率為3 Gy/min。

1.3 儀器

臺式離心機(jī)，德國Heraeus instrumennts 公司生產(chǎn)；電動勻漿機(jī)，CONNTROL公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)，ThermoFisher Scientific 公司生產(chǎn)；電泳儀PowerPacTMBasic，BIO-RAD 公司生產(chǎn)；轉(zhuǎn)膜儀Tras-Blot， BIO-RAD 公 司 生 產(chǎn)； 程 控 金 屬 浴Inanbator Thermoelectric公司生產(chǎn)。

1.4 試劑

哺乳動物組織總蛋白提取試劑、小鼠anti-β-actin一抗、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、過硫酸銨Ammonium Persulfate，均購自博士德生物工程有限公司；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.5 動物分組及照射

100 只雄性BALB/c 小鼠，隨機(jī)分為3 個不同劑量的電子線照射組(每組30 只)和1 個空白對照組(10 只)。照射組采用直線加速器全身照射小鼠，每次照射30只，照射劑量依據(jù)之前基因芯片篩選時的有效劑量設(shè)定，分別為1、2、4 Gy，劑量率為3 Gy/min。

1.6 Western blot檢測

1.6.1 總蛋白提取和濃度測定分別于照射后12、48、72 h將小鼠麻醉后摘取肝臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗數(shù)次后，稱取100 mg，加入蛋白裂解液(含1 μL PMSF)，用超聲破碎儀進(jìn)行組織勻漿。勻漿后靜置3 h，后離心取上清置于-20 ℃保存。按照BCA 法制備蛋白樣品，用酶標(biāo)儀測定樣品的蛋白濃度。

1.6.2 進(jìn)行SDS-PAGE電泳按比例配制12%的分離膠和8%的濃縮膠，加入濃度為5 μg/μL的蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，采用恒壓的模式，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處停止。

1.6.3 轉(zhuǎn)膜SDS-PAGE 結(jié)束后，按照標(biāo)準(zhǔn)的“三明治”方法將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST洗3次，采用濃度為5%的BSA封閉1 h，漂洗后放入一抗稀釋液孵育過夜。然后漂洗3 次，放入HRP標(biāo)志的二抗稀釋液中，室溫孵育2 h。

1.6.4 顯影將配制好的超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜蛋白面充分接觸，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對分子質(zhì)量和光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，積分光密度比值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 1 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

Western blot 檢測1 Gy 電子線照射后3 個時間點小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達(dá)水平，結(jié)果采用檢測蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin積分光密度的比值表示，見圖1 和表1。與對照組比較，照射后3 個時間點，IGF-1 蛋白的積分光密度比值除了照射后48 h 時＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白的表達(dá)情況相同，積分光密度比值均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，1 Gy電子線照射后，小鼠肝臟組織中IGF-1蛋白在照射后48 h 時表達(dá)增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白在照射后12、48和72 h時表達(dá)均減少。

2.2 2 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達(dá)水平，結(jié)果見圖2和表2。與對照組比較，照射后3個時間點，IGF-1 蛋白和IGFBP4 蛋白的表達(dá)情況相同，與β-actin積分光密度的比值除了照射后48 h時＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1蛋白的積分光密度比值，在照射后12 h 時＞1，48、72 h 時＜1(P＜0.05)；IGF1R蛋白的積分光密度比值在各個時間點均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1和IGFBP4蛋白在照射后48 h時表達(dá)增加，其余時間點為表達(dá)減少。IGFBP1蛋白在照射后12 h時表達(dá)增加，48和72 h時為表達(dá)減少。IGF1R蛋白在照射后3個時間點均呈現(xiàn)為表達(dá)減少。

圖1 Western blot檢測1 Gy電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表1 1 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達(dá)水平比較

圖2 Western blot 檢測2 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表2 2 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達(dá)水平比較

2.3 4 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長因子相關(guān)蛋白表達(dá)情況

4 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對表達(dá)水平，結(jié)果見圖3 和表3。與對照組比較，IGF-1、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達(dá)情況相同，與β-actin 積分光密度的比值，在照射后的3個時間點均＜1(均為P＜0.05)；IGF1R 蛋白的積分光密度比值除了在照射后12 h 時＞1，48、72 h 時均＜1(均為P＜0.05)。由此可見，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1和IGFBP4 蛋白均表達(dá)減少。IGF1R 蛋白在照射后12 h點為表達(dá)增加，48、72 h點均為表達(dá)減少。

圖3 Western blot 檢測4 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表3 4 Gy 電子線照射后不同時間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

胰島素樣生長因子Ⅰ是多肽類生長因子，與其相應(yīng)受體IGF-1R 結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖等生物學(xué)過程，參與機(jī)體大部分促生長的代謝活動。因此生命活動的不同階段內(nèi)，IGF-1 在機(jī)體的大部分組織中均有表達(dá)，但主要的合成器官仍是肝臟[9-11]。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 與炎癥及肝纖維化進(jìn)展有重要關(guān)系，在炎癥的刺激下，肝細(xì)胞超表達(dá)IGF-1，IGF-1 促使肝細(xì)胞增殖，加強(qiáng)肝臟的合成和代謝功能，從而促進(jìn)炎癥的恢復(fù)[12-14]。但肝臟受到長期損害，能夠表達(dá)IGF-1 的肝細(xì)胞減少，故IGF-1 水平降低。因此，肝臟中IGF-1 的含量是肝臟功能好壞的指標(biāo)之一。同時，由于肝臟是血液循環(huán)中IGF-1和IGFBPs的主要來源，肝臟受損時，IGF 系統(tǒng)會發(fā)生不同程度的改變，因此肝臟受損對IGF系統(tǒng)的影響也尤為重要。

本課題組前期利用基因芯片對60Co 射線照射的人肝細(xì)胞株進(jìn)行輻射相關(guān)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子家族中的基因差異表達(dá)顯著。因此選擇其為研究對象，對照射后人肝細(xì)胞株不同時間胰島素生長因子基因表達(dá)水平的改變進(jìn)行了分析。本實驗從動物水平上觀察比較照射后不同時間小鼠肝臟中胰島素生長因子蛋白的表達(dá)情況。通過從照射后不同時間點的角度分析可看出：①電子射線照射劑量為1 Gy時，照射后3個時間點，小鼠肝臟中4種蛋白表達(dá)總體呈現(xiàn)為表達(dá)減少。其中僅IGF-1 蛋白在照射后48 h 時表達(dá)增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋 白 在 照 射 后12、48 和72 h均表達(dá)減少。②照射劑量為2 Gy時，照射后3個時間點IGF-1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)趨勢總體為下調(diào)，其中IGF-1、IGFBP4 蛋白在照射后48 h 以及IGFBP1 蛋白在照射后12 h 表達(dá)增加，其余時間點均表達(dá)減少。IGF1R 蛋白在照射后3 個時間點均呈現(xiàn)為表達(dá)減少。③照射劑量為4 Gy 時，照射后3 個時間點，IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白的表達(dá)情況相同，均為表達(dá)減少；IGF1R蛋白除了在照射后12 h時表達(dá)增加，其余4 個時間點均為表達(dá)減少。對比發(fā)現(xiàn)照射劑量為2 Gy 時IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白均出現(xiàn)了表達(dá)增加，IGF1R蛋白在照射劑量達(dá)到4 Gy時出現(xiàn)了表達(dá)增加。此4 種蛋白表達(dá)的情況與小鼠肝臟中基因表達(dá)情況相同，進(jìn)一步驗證了基因表達(dá)的結(jié)果，同時也表明電子輻射對胰島素生長因子體系的影響是錯綜復(fù)雜的，但總體表現(xiàn)為降低這4 種蛋白的表達(dá)。

上述4 種蛋白均屬于胰島素生長因子家族中的一員，其中IGF-1 通過與IGF1R 結(jié)合來調(diào)控各種細(xì)胞的增生、分化和凋亡進(jìn)程，IGFBP1 與IGFBP4 主要用于運輸和調(diào)節(jié)IGF-1，控制IGF-1 運輸及代謝，調(diào)控IGF-1 定位于特定的組織及細(xì)胞上，決定IGF-1 的組織特異性[15-18]。肝細(xì)胞為4 種蛋白的主要分泌器官，TUNEL 法檢測到照射后6 h，小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，從側(cè)面印證了蛋白的下調(diào)表達(dá)結(jié)果。同時肝細(xì)胞在受到放射損傷后會立即進(jìn)入增殖修復(fù)的過程，IGFIR和IGF-1可以促進(jìn)這一修復(fù)過程。而本實驗發(fā)現(xiàn)照射后IGF-1和IGF-1R蛋白表達(dá)下調(diào)，會影響到放射性損傷后肝組織的自我修復(fù)。

本研究利用Western blot 技術(shù)，采用電子線全身照射BALB/c 小鼠，觀察比較小鼠肝臟受到不同劑量照射及照射后不同時間點IGF-1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF-1 蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果表明，4 種基因和蛋白的表達(dá)水平基本上以下調(diào)表達(dá)趨勢為主，可為研究輻射對肝臟的早期損傷提供依據(jù)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。