基于TCGA數據庫分析腫瘤突變負荷在肌層浸潤性膀胱癌預后評估中的價值

石海林，何天基，劉 峰，蔡孟會，葛 波，*

(1．桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 桂林541001；2．桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 桂林 541199)

膀胱癌是常見惡性腫瘤之一，據估計2020 年美國將新確診81 400 例膀胱癌，同期約有17 980 人死于此疾病[1]，其中肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)(即T 分期≥T2)占比超過25%，在過去的30 多年里其標準治療方式仍為膀胱癌根治術，但術后的生活質量差，術后5 年生存率小于30%[2]，而隨著免疫治療的不斷應用，使得部分腫瘤患者生存率得到較大幅度的提高。免疫治療的代表藥物有PD- 1/PD- L1 等免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)，自2016 年至今，FDA 已批準超過5個ICIs用于部分MIBC/轉移性膀胱癌的免疫治療[3]，臨床上多采用檢測PD-L1/腫瘤比例評分(tumor proportion score，TPS)的表達來判斷和預測免疫治療的有效性，但其患者療效反應仍小于25%，因此開發(fā)預測免疫療效的生物標志物成為重要的研究熱門方向[4]。腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)是在腫瘤樣品中基因的外顯子編碼區(qū)每百萬堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數[5]，是判斷腫瘤免疫治療療效的新興生物標志物，突變總數越多其被免疫系統(tǒng)識別越高，免疫療效則更佳。研究表明高TMB可提高非小細胞肺癌和乳腺癌等實體瘤免疫治療的生存期[6-7]，相關研究顯示膀胱癌的突變率高居第三，但眾多的基因突變與TMB 和免疫應答之間的關系在MIBC 中尚不明確[8-9]，因此本文通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)測序數據分析TMB與免疫應答預后的關系，有望發(fā)現可預測MIBC 免疫治療療效的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

TCGA 官網(https://cancergenome.nih.gov/)下載膀胱癌測序數據(V22.0)，得到414 例膀胱癌測序數據和19例正常膀胱組織的數據及相關臨床信息，同樣從TCGA數據庫下載膀胱癌的測序突變數據。

1.2 MIBC的TMB分析

使用R軟件中的“maftools”包對所下載的突變數據進行可視化，每個MIBC 樣本的TMB 表達量是通過將突變總數/目標編碼區(qū)域的大小來計算的，通過PERL(https://www.perl.org/get.html)語言提取TMB 的表達量，結合患者的生存時間、生存狀態(tài)及相關臨床信息進行分析；從ImmPort 數據庫(https://www.immport.org/)下載參與免疫活動過程的免疫相關基因，結合利用“Limma”包找出高低TMB 分組后的差異表達顯著的基因，取兩者交集后得到免疫相關基因(設置標準為log2FC＞2及|log2FC|＞2)；采用“Survival”包對得到的差異表達的免疫相關基因進行單、多變量COX回歸分析及總生存分析(overall survival，OS)；利用GEPIA2 數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)對差異表達的免疫基因進行無疾病生存分析(disease-free survival，DFS)；將得到COX模型行Kaplan-Meier 生存分析，以曲線下面積(receiver operating characteristic，ROC)判斷模型的準確性；最后采用oncomine 數據(https://www.oncomine.org/resource/main.html)跟HPA(https://www.proteinatlas.org/)數據庫對OS及DFS均有統(tǒng)計學意義的基因進行驗證。

1.3 免疫細胞與TMB亞型之間的相關性

應用CIBERSORT 算法計算浸潤免疫細胞的表達量，該算法是采用反卷積算法來計算22種腫瘤中浸潤的免疫細胞的表達量[10]，其準確性已通過流式細胞學實驗在肝癌、乳腺癌等癌癥中驗證，當P值＜0.05時認為免疫細胞的表達量差異是有統(tǒng)計學意義的。

1.4 統(tǒng)計學分析

我們以總突變頻率數表達量的中位值為標準，將患者分為高、低TMB兩組，結合生存狀態(tài)及時間進行Kaplan-Meier 生存曲線分析，并通過對數秩檢驗進行比較，采用單因素方差分析、Tukey 多重比較檢驗和未配對雙尾t檢驗分析臨床病理特征與相應TMB 的相關性，單、多因素COX回歸分析差異表達的基因進行預后分析。通過未配對t檢驗評估高TMB 組和低TMB組浸潤免疫細胞的差異。具體標準為校正后P值(false discovery rate，FDR)＜0.01 和 差 異 倍 數(fold change，FC)＞2，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 MIBC體細胞突變特征

我們通過TCGA 數據庫官網下載得到414 例膀胱癌及19 例正常組織信息，其中375 例MIBC 患者(已剔除≤T1的5例及T分期未知的34例)信息，將突變數據可視化后可知超過97%(364/375)MIBC 患者存在突變(圖1A)，說明MIBC 突變頻率非常高，其中錯義突變、無義突變、單核苷酸變異(SNP)和C＞T 突變較多，突變基因排在前10 位的分別為TP53、TTN、KMT2D、MUC16、ARID1A、KDM6A、SYNE1、PIK3CA、RB1、RYR2，見圖1B～G。

2.2 MIBC的TMB生存預后及臨床相關性

以375 例MIBC 患者TMB 中位值分為兩組，其中低TMB 組為184 例，高TMB 組191 例，采用R 軟件的Survival 包行Kaplan-Meier 分析評價TMB 在MIBC 中與生存預后的相關性，可知高TMB 組患者生存期較低TMB組更長(P＜0.01)，說明高TMB可能使MIBC患者接受免疫治療效果更佳。MIBC 患者結合相關臨床信息進行相關性分析可知，在年齡分組(65 歲為界)、性別、腫瘤組織學分級(高低級)各組之間的TMB 表達量差異明顯，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而TMB 的表達與MIBC 患者吸煙、TNM 分期、臨床分期等未見明顯相關關系(P＞0.05)(圖2A～D)。另外按TMB 表達量進行分組，利用Limma 包進行分析，Pheatmap 包進行可視化，得到231 個差異表達的基因。將差異表達基因結合ImmPort 數據庫下載得到的2 498 個免疫功能基因，取交集后得到75 個具有差異表達的免疫功能基因，再對預后因素進行單因素COX 回歸分析得到12個與預后密切相關的免疫功能基因(CD1A、IFNG、KIR2DL4、CXCL14、CXCL11、MARCO、CMA1、CRH、NRG1、RLN1、IL1RL1、SSTR5)，然后進行多因素COX 回 歸 得 到 高 表 達SSTR5[95%CI(0.304，0.918)]、KIR2DL4[95%CI(0.481，0.917)]的患者生存預后更佳，而低表達IL1RL1[95%CI(1.023，1.436)]的患者預后更佳(P＜0.05，圖2E～G)。

圖1 MIBC遺傳突變

圖2 TMB預后分析與臨床信息的相關性分析

2.3 免疫基因的數據庫驗證

GEPIA2 數據庫結果提示高表達KIR2DL4及低表達白介素1 受體樣1(IL1RL1)的患者無疾病生存期更長，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3A 和3B)；以環(huán)狀肽激素生長抑素受體(SSTR5)、KIR2DL4及IL1RL1構建的COX 風險模型得到低風險組生存時間更長(P＜0.001)，ROC為0.71，表明該模型準確性較好(圖3C和3D)。將KIR2DL4和IL1RL1免疫相關基因分別在Oncomine及HPA數據庫進行驗證，KIR2DL4基因及其所編碼的蛋白在腫瘤組織中明顯高表達，而IL1RL1及其編碼的蛋白在MIBC 染色強度顯著低于癌旁組織，得到IL1RL1在MIBC 組織中的表達顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3E和3F)。

2.4 TMB富集分析

將所得到的差異表達基因進行富集分析，用“Limma”包分析TMB 相關的MIBC 差異表達基因，得到上調基因83 個，下調基因148 個。通過GO(gene ontology)功能富集分析可知在生物過程(molecular function，BP)中主要為體外配對組織、第二信使介導、淋巴細胞趨化性、白細胞正性調節(jié)等功能；細胞成分(cellular component，CC)中主要為內質網內腔、囊腔等；分子功能(biological process，MF)中主要為受體配體活性、肌動蛋白結合、糖胺聚糖結合、生長因子活性等功能(圖4A)，表明相關基因深度參與機體的免疫反應。在KEGG 富集分析中確定差異表達基因最豐富的途徑，包括細胞因子細胞蛋白受體內含子、趨化因子信號通路、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、腫瘤相關通路等(圖4B)。

圖3 免疫基因的數據庫驗證

圖4 TCGA數據庫中MIBC基因富集圖

2.5 TMB與免疫細胞相關性

在腫瘤突變過程中往往形成更多的新抗原，使腫瘤具有更高的免疫原性。GO 富集分析表明差異表達基因參與腫瘤微環(huán)境的免疫過程，但腫瘤微環(huán)境中免疫細胞眾多，我們可以采用CIBERSORT 算法計算浸潤免疫細胞的分數，結果表明，與正常膀胱組織比較，高TMB 組的腫瘤CD8+T 細胞、活化的CD4+T 細胞、嗜酸性粒細胞表達較高，而在低TMB 組中記憶B細胞及未活化的肥大細胞表達比例較高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5)。

圖5 高、低TMB組與浸潤免疫細胞的相關性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是體細胞突變不斷積累的結果，突變的類型主要包括非同義突變、同義突變、插入或刪除和堿基錯配，實際上在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中基本都具有非同義突變，在不同的腫瘤類型中遺傳改變的頻率有明顯的差異，由于突變后會增加免疫原性，但為避免被免疫系統(tǒng)檢測并清除，因此腫瘤往往上調免疫檢查點[11]。而驅動基因突變可以導致腫瘤的發(fā)生，使大量的體細胞突變可以產生新抗原，新抗原可以激活CD8+的細胞毒性T 細胞，從而發(fā)揮T 細胞介導的抗腫瘤效應。因此，當基因變異數目累積增多時，就會產生更多的新抗原，進而被免疫系統(tǒng)識別的可能性就越大，對于免疫治療，癌細胞TMB越高，可能產生的新抗原越多，腫瘤的抗原免疫原性越高，T 細胞反應和抗腫瘤反應越強，更加適合免疫治療[12]；既往研究顯示，在接受PD-1/PD-L1 免疫檢查點抑制劑治療的患者，與TMB密切相關的非同義突變數量與腫瘤的客觀緩解率(ORR)、持續(xù)臨床獲益時間及無進展生存期(PFS)的改善均呈正相關；TMB 最初是在使用Ipilimumab 或Tremelimumab 治療晚期黑色素瘤患者時作為預測療效的生物標記物，發(fā)現擁有高水平TMB的黑素色瘤和非小細胞肺癌患者對PD-1/PD-L1 免疫檢查點抑制劑的療效往往高于低水平TMB 表達的患者[13]。當前研究大多只將TCGA 膀胱癌數據粗略進行分析，但尚未有單獨進行MIBC的研究，TCGA數據庫在TNM 分期上以MIBC 患者占大多數，因此MIBC 與TMB 的關系尚不清楚[14-15]。本次研究375 例MIBC 患者中97%患者存在突變，說明MIBC 患者中突變頻率非常高，其中錯義突變、無義突變、單核苷酸變異(SNP)和C＞T 突變占較多，最常見的5 個突變基因是TP53、TTN、KMT2D、MUC16和ARID1A。TP53是 抑 癌 基因，通過調節(jié)細胞周期從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]；TTN為編碼肌節(jié)的肌聯蛋白基因，與擴張型心肌病可能存在關聯，但在腫瘤發(fā)生過程的作用尚有待進一步研究[17]；KMT2D是一種調節(jié)腫瘤生長和轉移的相關蛋白，在膀胱癌中，KMT2D作為腫瘤抑制因子，其突變可導致腫瘤細胞的存活、遷移和侵襲[18]；MUC16是一種跨膜蛋白，可能參與腫瘤的轉移[19]；ARID1A(AT 豐富結合域1A)基因，是染色質重塑復合物SWI/SNF 的核心亞基，參與DNA復制、轉錄、修復等過程，并和組蛋白共價修飾復合物等進行染色質重塑，與抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展相關，有研究數據表明，當ARID1A 發(fā)生失活變異時，可導致錯配修復(MMR)蛋白功能被削弱，具有致癌作用，ARID1A 失活突變可導致TMB 升高，促進CD8+T 細胞浸潤和PD-L1 表達，提示失活突變所導致的免疫微環(huán)境變化更利于免疫治療[20]。因此，TMB水平高的患者產生新抗原多，腫瘤會被大量特異性T細胞攻擊，抗PD-1治療可以使腫瘤T細胞反應得以更充分的發(fā)揮，因此高水平TMB的腫瘤患者對抗PD-1 治療更敏感，TMB 已經被證明與ICIs 治療黑色素瘤、肺癌等的臨床療效相關，被認為是各種類型免疫治療反應的獨立預測因子，相關臨床指南也推薦TMB可作為預測免疫治療的標志物[21]。

在本研究中，我們發(fā)現375例MIBC患者中高水平TMB 會影響MIBC 的預后，可增強免疫治療效能，高TMB可能反映了存在突變相關的新抗原，可增加淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤，從而提高免疫抗腫瘤效應，這與靶向藥物的有效性和臨床結果密切相關[22]。隨著年齡的增長、男性患者及腫瘤分級較高的MIBC患者TMB 較高；年齡增長導致體細胞突變頻率更高，而男性患者可能因較多雄激素而出現TMB升高，但還有待進一步研究。另外我們還在低TMB組和高TMB組之間鑒定出了231 個差異表達基因(83 個上調和148 個下調)，其中高表達SSTR5、KIR2DL4的患者生存預后更佳，而低表達IL1RL1的患者預后可能較佳，并進行GO跟KEGG富集分析，發(fā)現許多基因涉及免疫應答和趨化因子信號通路，這些結果表明，TMB及這些TMB相關基因與腫瘤微環(huán)境的變化密切相關[23-24]。SSTR5廣泛分布于人體的所有組織中，通過改變第二信使(如cAMP)的水平，或通過激活離子通道，改變細胞內鈣水平來實現抗增殖作用，從而導致蛋白酪氨酸磷酸酶誘導細胞周期停滯或凋亡抑或通過抑制生長因子的釋放來實現腫瘤抑制，當SSTR5 高表達時可抑制腫瘤生長[25]。自然殺傷(NK)細胞表面的免疫球蛋白樣受體2DL4(KIR2DL4)，抑制其與配體人白細胞抗原G 的結合增強NK細胞的殺傷功能從而抑制細胞增殖[26-27]。白介素1 受體樣1(IL1RL1)由328 個氨基酸組成，可被促炎因子刺激誘導，并可能參與輔助T 細胞的功能，與白細胞介素1受體I型(IL1R1)、II型(IL1R2)和白細胞介素1受體樣2(IL1RL2)在2q12染色體上形成細胞因子受體基因簇，該基因的可變剪接導致多個轉錄本變異，參與機體多種炎性免疫反應，與腫瘤的發(fā)生和侵襲轉移密切相關，通過影響腫瘤免疫微環(huán)境，并可能直接在腫瘤細胞表面表達而直接影響細胞的生物學行為，其在腫瘤中的具體作用機制還需進一步研究[28]。

腫瘤中免疫細胞浸潤是腫瘤的一個特征，許多惡性腫瘤都有一個復雜的趨化因子網絡，影響這種免疫細胞的程度和表型，以促進腫瘤細胞的生長、轉移[27]。在本研究中，我們發(fā)現，與正常膀胱細胞相比，高TMB組的MIBC中CD8+T細胞、活化的CD4+T細胞、嗜酸性粒細胞表達較高，而在低TMB組中記憶B 細胞及未活化的肥大細胞表達比例較高，這與目前相關研究基本一致，但需大規(guī)模實驗驗證[28]。這些結果表明TMB能影響免疫細胞的浸潤，新抗原可吸引免疫系統(tǒng)的效應細胞；因此，建立一個癌癥-免疫系統(tǒng)平衡對機體保持健康至關重要。CD8+T細胞在特定條件下可分化為裂解效應細胞，增加γ-干擾素(IFNγ)、Fas 配體(FASL)、顆粒B 的表達，抑制腫瘤細胞增殖[29]。腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞的高浸潤與MIBC患者生存呈正相關，嗜酸性粒細胞參與介導組織損傷修復，維持內環(huán)境的穩(wěn)定等多種功能，其所分泌的多種細胞因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關[30-31]；而肥大細胞可能有助于腫瘤血管生成，在腫瘤生長中起重要作用，低TMB組肥大細胞可促進腫瘤生長和轉移，但高TMB 中產生新的抗原可能干擾腫瘤增殖[32]，這些研究表明TMB的水平高低與免疫微環(huán)境變化密切相關。

本研究通過TCGA 數據庫分析表明免疫治療在高TMB 的MIBC 患者中可能具有較好的預后，存在較大的潛在臨床應用價值；發(fā)現了可能影響免疫細胞浸潤的TMB 相關基因，初步解析免疫細胞在MIBC 腫瘤微環(huán)境中的差異表達，以此為MIBC 的免疫治療在臨床上的應用提供理論基礎，但尚需更大規(guī)模、前瞻性、多中心的實驗研究進一步證實。