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    基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術的石見穿化學成分分析及其治療胃癌的網(wǎng)絡藥理學探究

    2020-12-04 02:23:20黃雯潔魯曉娜王玉蘭劉沈林
    四川大學學報(自然科學版) 2020年6期
    關鍵詞:酚酸丹參靶點

    黃雯潔, 阮 帥, 溫 芳, 王 惠, 魯曉娜, 王玉蘭, 胡 玥, 劉沈林, 舒 鵬

    (1. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院, 南京 210000; 2.南京中醫(yī)藥大學藥學院, 南京 210000)

    1 引 言

    石見穿系唇形科鼠尾草屬華鼠尾草SalviachinensisBenth的干燥地上部分,別名華鼠尾草、紫參、小丹參、石打穿等.其性味苦、辛、平,歸胃、肝、肺經(jīng),具有清熱解毒、活血止痛、消腫散結的功效.民間主要用石見穿治療噎嗝、痰喘、赤白帶、癰腫、瘰疬等疾病[1].近年來石見穿作為抗腫瘤中藥被廣泛應用于各組方中,其各活性成分的抗腫瘤作用在肺癌[2]、肝癌[3]、胃癌[4]、腸癌[5]等多種惡性腫瘤被證實.現(xiàn)有研究已初步建立了石見穿的藥物質(zhì)量標準[6],為進一步分析石見穿的有效化合物成分,闡明其藥效物質(zhì)基礎,我們使用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術對石見穿水提物的主要化學成分進行了解析,提供了更為全面的石見穿水提物成分信息,以供明確其體內(nèi)藥效活性成分.

    胃癌是臨床常見的惡性腫瘤,根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù),胃癌在全球腫瘤發(fā)病率中居第五位,死亡率居第三位[7].手術和化療為胃癌主要治療手段,然而其不良反應及毒副作用較為顯著,且難以發(fā)揮長期抗腫瘤作用.中藥具有多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)、副作用小等優(yōu)勢,逐漸在腫瘤治療中得到科研工作者的重視.石見穿在胃癌中的抗腫瘤療效已經(jīng)得到多項研究證實[8-9].因此,本文在對石見穿進行藥效成分分析的基礎之上,運用網(wǎng)絡藥理學研究方法,通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)、PubChem數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫等生物信息平臺,從藥物、化學成分、靶點、疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),探究石見穿治療胃癌的作用機制.

    2 材料與方法

    2.1 材 料

    石見穿藥材來源于南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房,購自安徽大別山中藥飲片有限公司,批號:190601,產(chǎn)地:安徽,質(zhì)量標準參照《中國藥典》2015年版.經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院于瑞蓮副教授鑒定為為唇形科植物華鼠尾草SalviachinensisBenth的地上部分.標本保存于南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室.甲醇(TEDIA,批號18095056)、甲酸(江蘇強盛功能化學股份有限公司,批號20160412)、乙腈(Merch,批號1.00030.4000).

    Ultimate 3000高效液相色譜儀(1000 mm×1000 mmm×1000 mm)、SIL-20A XR UFLC儀(日本Shimadzu公司)、Triple TOF 5600 System-MS/MS高分辨三重四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)、電子天平(天津天馬衡基儀有限公司)SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(南京文科儀器設備有限公司)、KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、PST-JY-10普力菲爾純水機(上海富詩特儀器設備有限公司).

    2.2 方 法

    2.2.1 供試品制備 取干燥石見穿藥材粉末1 g,精密稱定,加10倍量雙蒸水浸泡30 min,回流提取2次,第1次30 min,第2次20 min,合并兩次濾液,70 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,用無水乙醇復溶至10 ml容量瓶中即可.

    2.2.2 色譜條件 色譜柱為Hedera C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:0.1%甲酸水(B)-0.1%甲酸甲醇(C),梯度洗脫 (0~7 min,97%~97% B;7~15 min,97%~50% B;15~20 min,50%~10% B;20~25 min,10%~97% B;25~37 min,97%~97% B),流速1 mL·min-1,柱溫30℃,進樣量5 μL.DAD檢測波長為260 nm.

    2.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源負離子模式;質(zhì)量掃描范圍m/z 50~1 500;離子源溫度550 ℃;氣簾氣流速40 L/min;霧化氣流速55 L/min;輔助氣流速55 L/min;噴霧電壓-4 500 V;去簇電壓-100 V.

    2.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用Peakview 2.0軟件(美國AB SCIEX公司),根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的一級質(zhì)譜碎片信息及精確相對分子質(zhì)量,結合擬合分子式、質(zhì)量偏差范圍(δ)≤5×10-6,初步預計可能的化合物,再通過比對SciFinder數(shù)據(jù)庫、質(zhì)譜碎片信息,結合參考文獻對化合物進行結構鑒定.

    2.2.5 胃癌疾病靶點及石見穿潛在活性成分篩選 在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中輸入“gastric cancer”“ gastric carcinoma” “stomach cancer”“ stomach carcinoma”檢索胃癌的相關靶點.

    藥物成分在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄過程到達靶器官發(fā)揮疾病治療作用,口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)是中藥成分參與體內(nèi)過程的關鍵參數(shù),可作為藥物活性成分篩選指標[10].將液質(zhì)聯(lián)用解析鑒定所得的化學成分在TCMSP平臺以OB和DL為參數(shù)進行篩選,為盡可能全面篩選,將條件設定為OB≥25%,DL≥0.05.

    2.2.6 篩選石見穿治療胃癌的潛在靶點 通過PubChem數(shù)據(jù)庫,將篩選后的活性成分轉(zhuǎn)化為SMILES結構式,將SMILES結構導入SwissTargetPrediction網(wǎng)站,對石見穿活性成分的所有潛在靶點進行預測.本研究中以每個SMILES結構預測靶點的Probabillity TOP20為標準進行篩選.將潛在活性成分的預測靶點與疾病靶點取交集,獲得石見穿治療胃癌的靶點集.

    2.2.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將石見穿治療胃癌的靶點集導入DAVID數(shù)據(jù)庫,限定物種為Homo sapiens,進行GO富集分析和KEGG通路富集分析.GO富集分析由生物過程(Biological process,BP)、細胞組分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三個部分組成.本研究中GO分析及KEGG分析均以P<0.05作為篩選標準.

    2.2.8 構建關鍵靶點“蛋白-蛋白相互作用”網(wǎng)絡 將靶點信息導入STRING數(shù)據(jù)庫,物種設置為Homo sapiens,進行靶點蛋白間的相互關聯(lián)分析,導出文件中的node1、node2和組合分數(shù)(combined score)信息,以組合分數(shù)(combined score)≥0.4作為篩選條件,為盡可能全面探究蛋白相互作用關系,將“max number of interactors to show 1stshell”拓展為“no more than 10 interactors”.使用Cytoscape 3.7.1軟件構建蛋白-蛋白相互網(wǎng)絡(PPI)圖,節(jié)點(node)的大小、形狀變化和顏色深淺反應自由度(Degree)大小,自由度越大,則越表明該節(jié)點在網(wǎng)絡中處于核心位置.

    3 結果與分析

    3.1 石見穿鑒定所得的化學成分信息

    按照上述液相色譜和質(zhì)譜條件對石見穿水提物樣品進行分析,總離子流圖(TIC)見圖1,在正負模式下色譜峰均比較豐富.為了獲得盡可能多的信息,本文采用正負兩種離子的全掃描檢測模式對石見穿的化學成分進行定性分析.根據(jù)TOF-MS質(zhì)譜得到化合物的精確質(zhì)荷比(m/z),Product Ion二級質(zhì)譜得到該質(zhì)量數(shù)的二級碎片離子,并參考相關文獻信息、結合化合物的化學鍵斷裂規(guī)律,對石見穿所含化合物結構進行定性分析,鑒定得到48個化合物,絕大多數(shù)成分為酚酸類化合物、另有少量黃酮類、萜類有機酸、多糖類物質(zhì)等.詳見表1.

    3.1.1 酚酸類 石見穿中含有大量酚酸類物質(zhì),為水溶性化合物,具有較強的藥理活性,是石見穿的最主要有機成分之一.研究根據(jù)文獻及數(shù)據(jù)庫從石見穿中鑒定得到的主要酚酸類物質(zhì)包括:丹參素(Danshensu)、原兒茶酸(Protocatechuic acid hesoxide)、原兒茶醛(Protocatechuic aldehyde)、丹參素葡萄糖(Danshensu-Glc)、綠原酸(Chlorogenic acid)、香豆酸(Coutaric acid)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)、迷迭香酸甲酯(Methyl rosmarinate)、1-咖啡奎寧酸(1-Caeoylquinic acid)、4-咖啡奎寧酸(1-Caeoylquinic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、咖啡酸葡萄糖(Caffeic acid-Glc)、阿魏酸(Ferulic acid).

    圖1 正(A)負(B)離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram in positive (A) and negative (B) ion mode

    酚酸類物質(zhì)結構解析以峰Rt3.39 min、峰Rt30.461 min、峰Rt31.82 min為例,通過對保留時間、碎片離子信息及參考文獻對照,確定其分別為丹參素(Danshensu)、丹酚酸B(Salvianolic acid B)及迷迭香酸(Rosmarinic acid).①保留時間為3.39 min,獲得m/z 197.045 6[M-H]-的準分子離子峰,根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出的分子式為C9H10O5,精確分子量誤差為0.3ppm,根據(jù)文獻[11]初步判定該峰為丹參素,二級質(zhì)譜圖見圖2A.二級質(zhì)譜圖中,此物質(zhì)在m/z197處產(chǎn)生大量的[M-H]-離子,并呈現(xiàn)m/z179[M-H-H2O]-和m/z135[M-H-H2O-CO2]-碎片離子,切合丹參素存在芳環(huán)上的鄰羥基,極易脫去一分子H2O后再脫去一分子CO2產(chǎn)生的特性.②保留時間為30.461 min,獲得m/z359.075 56[M-H]-的準分子離子峰,根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出的分子式為C18H16O8,精確分子量誤差為-1.6 ppm,根據(jù)文獻[27]判定該峰為迷迭香酸(Rosmarinic acid),二級質(zhì)譜圖見圖2B,m/z197為其母離子丟失一分子咖啡酸形成,另外可見丹參素的特征碎片m/z179、m/z135、m/z123.③保留時間為31.82 min,呈現(xiàn)m/z717.1443[M-H]-的準分子離子峰,匹配分子式為C36H30O16,精確分子量誤差為-2.5 ppm,結合文獻[13]判定該峰為丹參素的多聚體丹酚酸B(Salvianolic acid B),二級質(zhì)譜圖見圖2C,其結構中含有2個丹參素片段,分別失去一分子和兩分子丹參素得到碎片離子m/z519[M-H-C9H10O5]-和m/z321[M-H-2(C9H10O5)]-,少數(shù)m/z519發(fā)生麥氏重排,失去180Da,得到碎片m/z339,隨后側(cè)鏈斷裂,產(chǎn)生碎片m/z295,繼而再失去一分子H2O,產(chǎn)生碎片m/z 277.同理鑒定得到丹酚酸A(Salvianolic acid A)、丹酚酸J(Salvianolic acid J)、丹酚酸C(Salvianolic acid C)等酚酸類成分.

    圖2 丹參素(A)、迷迭香酸(B)、丹酚酸B(C)及山奈酚(D)的二級質(zhì)譜圖

    3.1.2 黃酮類 黃酮類化合物在質(zhì)譜中易于電離,碎片信息豐富,一般都具有C6-C3-C6的基本母核結構,本研究在石見穿中鑒定得到的黃酮類物質(zhì)主要有:山奈酚(kaempferol)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷.

    黃酮類物質(zhì)結構分析以峰Rt35.52 min為例,保留時間35.52 min,獲得準分子離子峰m/z287.0551[M+H]+,根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配出的分子式為C15H10O6,精確分子量誤差為0.3 ppm,通過對保留時間、碎片離子信息及參考文獻[14]對照,初步鑒定為山奈酚(kaempferol),二級質(zhì)譜圖見圖2D,主要離子碎片m/z153[M+H-C8H6O2]+是由準分子離子m/z287.0551[M+H]+C環(huán)上RDA裂解形成,m/z121 [M+H-C8H6O2-CO2]+由母離子m/z 153脫去一CO2產(chǎn)生,另外質(zhì)譜中可見其他離子碎片m/z213、m/z165、m/z157、m/z137、m/z135等,與文獻報道一致.同理鑒定得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷及山奈酚-3-O-葡萄糖苷等黃酮類成分.

    3.1.3 其他 另外,石見穿中還鑒定出了萜類有機酸,包括羥基積雪草酸(madecassic acid)、五靈脂三萜酸(goreishic acid)、積雪草酸(asiatic acid)、阿江欖仁酸(Arjunolic acid);香豆素類成分,包括6-羥基香豆素(6-Hydroxycoumarin)、8-羥基香豆素(8-Hydroxycoumarin)、7-羥基香豆素(7-Hydroxycoumarin)等以及氨基酸類物質(zhì)如色氨酸(tryptophan)等.

    3.2 石見穿活性成分及治療胃癌靶點分析

    3.2.1 胃癌靶點及石見穿潛在活性成分篩選 經(jīng)DisGeNET庫檢索(根據(jù)Uniprot ID號刪除重復靶點)共得到3770個胃癌疾病靶點,計算sore gad的平均值,篩選出sore gad≥0.049552的疾病靶點共740個.將液質(zhì)聯(lián)用解析鑒定結果在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索及條件篩選后,共得到9個具有良好生物學活性的化合物,具體見表2.

    表2 石見穿體內(nèi)活性成分表

    3.2.2 石見穿活性成分治療胃癌的潛在靶點分析 將石見穿活性成分每個SMILES結構預測靶點的Probabillity TOP20作為潛在活性成分的預測靶點與胃癌疾病靶點取交集,共獲得石見穿活性成分治療胃癌的潛在靶點18個,具體見表3.

    3.2.3 GO富集分析與KEGG通路富集分析 GO富集分析結果表明,石見穿在胃癌治療中共涉及到48個生物過程(BP),8個細胞組分(CC)以及27個分子功能(MF).

    生物過程方面,石見穿主要對藥物反應(Reponse to drug)、細胞藥物反應(Cellular response to drug)、細胞流體剪切應力反應(Cellular response to fluid shear stress)、蛋白質(zhì)分解代謝過程的負調(diào)控(Negative regulation of protein catabolic process)、胚胎植入(Embryo implantation)、一氧化氮生物修復

    表3 石見穿活性成分治療胃癌的靶點

    過程的正調(diào)控(Positive regulation of nitric oxide biosunthetic process)、膠原分解代謝過程(Collagen catabolic process)、對雌激素的反應(Response to estrogen)等生物過程進行調(diào)節(jié).

    細胞組分方面,石見穿對質(zhì)膜(Plasma membrane)、細胞質(zhì)(Cytosol)、基底外側(cè)質(zhì)膜(Basolateral plasma membrane)、細胞質(zhì)核周區(qū)(Perinuclear region of cytoplasm)、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)(proteinaceous extracellular matrix)、頂端質(zhì)膜(Apical plasma membrane)、細胞核(Nucleus)、細胞外隙(Extracelluar space)的作用較為顯著.

    分子功能方面,石見穿主要通過對酶結合(Enzyme binding)、蛋白結合(Protein binding)、鋅離子結合(Zinc ion binding)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性和配體激活的序列特異性DNA結合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity,ligand-activated sequence-specific DNA binding)、ATP酶活性與物質(zhì)跨膜運動(ATPase activity,coupled to transmembrane movement of substances)、相同蛋白結合(Identical protein binding)、異種運輸ATP酶活性(Xenobiotic-transporting ATPase activity)、芳香酯酶活性(Arylesterase activity)、金屬內(nèi)肽酶活性(Metalloendopeptidase activity)等分子功能發(fā)揮胃癌治療作用.

    KEGG通路富集分析結果表明,除去與胃癌無關通路,石見穿在胃癌治療中共涉及8條通路.富集潛在靶基因排名前五的通路依次為腫瘤通路(Pathways in cancer)、粘附連接(Adherens junction)、雌激素信號途徑(Estrogen siganaling pathway)、ABC轉(zhuǎn)運體(ABC transports)、腫瘤微小RNA(MicroRNAs in cancer).

    使用R語言將GO分析與KEGG分析結果(按p值升序排列TOP10)分別繪制成氣泡圖,圖中氣泡大小代表富集基因數(shù)的多少,氣泡顏色差異代表靶基因富集的顯著性大小(見圖3).

    圖3 GO富集分析與KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.3 Bubble diagram of GO analysis and KEGG analysis

    3.2.4 “蛋白-蛋白相互作用”網(wǎng)絡的構建 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖中共包含節(jié)點(node)35個,邊(edge)150條,平均節(jié)點度(average node degree)為8.57,平均局部聚類系數(shù)(avg. local clustering coefficient)為0.65,PPI豐度P值(PPI enrichment p-value)<1.0e-16.本文通過將“max number of interactors to show 1st shell”設為“no more than 10 interactors”以拓展探究蛋白相互作用關系,結果顯示處于核心位置Top5的靶點為EGFR(23)、CDH1(20)、CTNNB1(19)、PTGS2(19)、EGF(18),提示其在PPI網(wǎng)絡中發(fā)揮著關鍵作用.(見圖4).

    圖4 石見穿治療胃癌靶點的PPI圖Fig.4 PPI map of targets of Salvia chinensis in the treatment of gastric cancer

    4 討 論

    利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術可以得到高分辨率、高精度的質(zhì)譜數(shù)據(jù),根據(jù)化合物的結構及其裂解途徑并結合文獻數(shù)據(jù),可較準確的定性相關化學成分,因此,HPLC-Q-TOF-MS/MS應用于化合物結構鑒定可為中藥多組分鑒定研究提供可靠依據(jù),且具有廣闊的應用前景[35].本實驗中質(zhì)譜同時結合正負兩種離子模式,均可采集到較豐富的色譜峰,為石見穿水提物樣品的準確定性鑒定奠定基礎.一級質(zhì)譜是準確推測化合物分子結構必要的數(shù)據(jù),本研究在基于一級質(zhì)譜采集良好性基礎上,并對二級質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,再結合化合物相關裂解規(guī)律及文獻,從而對石見穿鑒定出大量酚酸類、黃酮類等48個化合物成分.本研究實現(xiàn)了對石見穿水提物成分的快速定性分析,該方法快速、簡便、靈敏度高,為石見穿質(zhì)量控制、藥理作用、臨床應用等研究奠定基礎.

    現(xiàn)有文獻已表明了石見穿在抗腫瘤方面的卓越效果[36],本研究對其水提物進行成分解析,分析得到48種化學成分,為現(xiàn)有石見穿成分研究中解析最為全面、所得成分最多的研究.同樣,在我們的研究中,也發(fā)現(xiàn)了石見穿中較具有代表性的幾種抗腫瘤成分,如丹參素、迷迭香酸、山奈酚等.與此同時,石見穿也是本研究團隊治療胃癌臨床效方“健脾養(yǎng)胃方”中的主要抗腫瘤藥物.健脾養(yǎng)胃方由首屆全國名中醫(yī)劉沈林教授根據(jù)胃癌“脾虛毒瘀”的基本病機,通過二十多年的臨床實踐所創(chuàng)制的.其通過一項歷時8年、納入病例489例、有9個協(xié)作單位參研的多中心大樣本國家中管局行業(yè)專項課題研究[37],證實在進展期胃癌術后協(xié)同化療,與單純化療相比,可使復發(fā)轉(zhuǎn)移風險下降32.8%(P=0.004 2);尤其對于胃癌Ⅲ期患者,復發(fā)轉(zhuǎn)移風險更是下降了34.7%(P=0.007 2).本方治療胃癌臨床療效顯著,石見穿作為組方中的重要抗腫瘤藥物,其治療胃癌的活性成分、作用靶點機制有待發(fā)掘.因此,在對該藥藥學分析基礎上,我們運用網(wǎng)絡藥理學研究方法,篩選出9個具有良好生物學活性的化合物,以胃癌治療為研究對象,獲得了石見穿活性成分治療胃癌的18個潛在靶點,常見重要靶點例如EGFR、CDH1、CTNNB1、PTGS2、EGF等,這些靶點在PPI圖中均位于核心位置,是連接多蛋白相互作用的重要基因.其中,EGFR家族對胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控已得到廣泛研究,胃癌以異質(zhì)模式過表達HER,尤其是EGFR和HER2,其在胃癌的細胞增殖和遷移中具有關鍵作用[38].以迷迭香酸類似物為代表的多種中藥成分,可降低胃癌細胞中EGFRmRNA表達,抑制胃癌細胞的增殖和遷移,并誘導其凋亡[39].EGF[40]作為上游通路可促進胃癌細胞遷移,以EGF-Grb2-DENND1A-Rab35信號通路與DENND1A和Grb2的相互作用可以調(diào)控胃癌細胞的遷移和侵襲.在石見穿治療胃癌的通路方面,KEGG富集分析預測了8條潛在通路,其中,粘附連接、ABC轉(zhuǎn)運體為我們熟知的腫瘤調(diào)控重要通路.粘附連接途徑包括了CREBBP、EP300、CDH1、CTNNB1、EGFR、MET、TGFBR2和ERBB2等多基因調(diào)控.Ge等[41]通過對78例進展期胃癌患者組織的全基因組測序,分析發(fā)現(xiàn)在粘附連接途徑中具有一個或多個突變的患者具有更好的總體生存率.ABC轉(zhuǎn)運體是與胃癌多藥耐藥密切相關的膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族,其最主要蛋白為ABCB1,此外還有ABCC1/ABCC2蛋白以及ABCG2蛋白,抑制這些蛋白表達可有效降低化療藥物在細胞內(nèi)的外排,直接降低耐藥的發(fā)生[42].

    然而石見穿藥物成分復雜,抗腫瘤機制亦趨于多方面多維度,本研究僅為該藥成分的定性分析鑒定及通過網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)平臺對其治療胃癌潛在靶點的預測.對于不同成分的含量分析、藥物活性分析及中藥用藥的毒理性分析尚待后續(xù)代謝組學等的進一步研究[43],并通過體內(nèi)外實驗驗證其作用靶點及通路機制,闡明其對胃癌的治療作用,為石見穿更廣泛的臨床應用提供科學的實驗依據(jù).

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