食用檳榔加工過程中真菌群落組成及變化研究

張祺玲 彭 玲 陳雪梅 徐遠芳 周毅吉 馮彥勇 李文革，*

(1湖南省核農學與航天育種研究所/湖南省農業(yè)生物輻照工程技術研究中心/生物輻照技術湖南省工程研究中心， 湖南 長沙 410125；2湖南口味王集團有限責任公司，湖南 益陽 413001)

檳榔(ArecacatechuL.)為四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟天)之首，由于檳榔咀嚼食用后帶來的欣快感和輕微興奮性致使許多人癡迷，因此全球約有6～7億人咀嚼檳榔，廣泛流行于亞洲地區(qū)，目前已成為世界上繼煙草、酒精和咖啡之后的第四大廣泛使用的嗜好品[1]。我國檳榔消費人口超5 000萬，消費地域覆蓋全國，主要集中在湖南地區(qū)[2]。同時湖南作為我國檳榔深加工中心，加工全國95%以上的檳榔，行業(yè)總產(chǎn)值超200億元，且每年以10%～20%的速度增長[3]。

隨著檳榔加工行業(yè)的日益發(fā)展，食用檳榔消費人群日益龐大，食用檳榔所存在的微生物超標和食品添加劑濫用等食品安全問題日益凸顯，雖然近年來國家法律法規(guī)不斷完善，監(jiān)管部門執(zhí)法力度不斷增強，檳榔企業(yè)安全意識不斷提高，食用檳榔的化學污染得到了有效控制，但由于食用檳榔加工流程復雜、加工工藝局限等原因，微生物污染尤其是霉變問題雖有所改善但依然是檳榔加工過程中亟待解決的主要質量安全風險[4-5]。因此，對食用檳榔加工過程中的真菌多樣性進行評價極為必要。

以Illumina MiSeq測序平臺為代表的第2代測序技術具有通量高、檢測速度快、能實現(xiàn)多樣本分析及關聯(lián)分析等特點[6-8]，已廣泛運用于腸道[9-11]、土壤[12-14]和發(fā)酵食品[15-17]等相關微生物的多樣性研究，其在食品微生物分子生態(tài)學研究領域的應用已逐步發(fā)展為評價食品微生物群落結構變化、監(jiān)測食源性病原菌動態(tài)特征以及控制食品質量等的首選方法[18]。本研究采集了食用檳榔加工過程中不同階段的檳榔籽樣品，基于高通量測序技術對不同加工階段的食用檳榔籽的真菌多樣性進行解析評價，以期為后續(xù)食用檳榔的安全性及品質提升提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 食用檳榔加工過程不同階段樣品采集自湖南某檳榔加工企業(yè)生產(chǎn)車間。食用檳榔加工過程主要包括發(fā)制(將檳榔加工配料溶解后加入檳榔中使檳榔入味的過程，在此過程中會加入蘇打釋放檳榔功效成分檳榔堿和檳榔次堿)、清洗、干燥、上膠(檳榔表面包裹明膠膜增加檳榔亮度的過程)、去芯、點鹵及包裝，跟蹤同一批次檳榔分別在加工過程中各階段完成后取樣(表1)，樣品均無菌隨機采集至透明PE袋中，每個樣品設置3個重復，置于含有冰袋的采樣箱中低溫運回實驗室，編號后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 檳榔樣品信息表Table 1 Sample information

1.1.2 主要試劑 E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美國Omega生物試劑公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase，美國NEB公司；AP-GX-50 DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，美國Invitrogen公司；真菌通用引物ITS1-1737F(5′-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A GG-3′和ITS2-2043R(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T GC-3′)，其中在前引物中加入7 個核苷酸標簽(barcode)，武漢菲沙基因有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Nanodrop 2000型超微量紫外分光光度計，美國Thermo Scientific公司；2720型PCR擴增儀，美國ABI公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO(130)型凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶生物技術有限公司；MiSeq PE250高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取 參照E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒說明書提取樣品中微生物總DNA，用超微量紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提的DNA質量。

1.3.2 PCR擴增 利用引物ITS1-1737F和ITS2-2043R對真菌rRNA基因ITS1區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增體系25 μL：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，引物ITS1-17137F(10 μmol·L-1)1 μL，引物ITS2-2043R(10 μmol·L-1)1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR擴增程序：98℃預變性2 min；98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，27個循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。

1.3.3 PCR產(chǎn)物回收純化及高通量測序 PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳后對目標片段進行切膠回收，按照凝膠回收試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物由武漢菲沙基因有限公司使用Miseq高通量測序平臺進行雙端測序分析。

1.3.4 原始數(shù)據(jù)處理 對雙端序列作質量篩查去除低質量 Reads后進行拼接，從而獲得樣本有效序列[19]，剔除疑問序列及嵌合體序列[20]，最后獲得優(yōu)質序列。

1.3.5 生物信息分析 以97%相似度劃分操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，采用真菌ITS數(shù)據(jù)庫UNITE[21]比對分析獲取每個OTU所對應的分類學信息，進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析及分類學組成分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本 T 檢驗，P<0.05 表示顯著差異；采用R軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 食用檳榔加工過程中真菌測序序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計和OTU分類

對各樣本測序序列進行分析整合，經(jīng)剔除疑問序列等質控后，食用檳榔加工過程中的24個樣品共得到優(yōu)質序列1 079 104條，序列長度主要分布于200～250 bp，按照97%相似度聚類分析共分類出820個OTU。由表2可知，加工過程中檳榔籽中去芯籽和成品籽OTU數(shù)最多，未入蘇發(fā)籽和洗籽OTU數(shù)最少。

表2 食用檳榔加工過程中真菌測序序列數(shù)及OTU數(shù)Table 2 Fungi read counts and number of OTUs in processing of edible betelnut

2.2 食用檳榔加工過程中真菌群落Alpha多樣性分析

稀釋曲線反映不同測序深度下各樣品中物種的相對豐度，能在一定程度上衡量每個樣本的多樣性情況[22-23]。由圖1可知，本試驗所有樣本曲線均隨橫坐標測序數(shù)量的增大趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠，能夠充分反映樣品的微生物信息且滿足后續(xù)生物信息學分析。

樣本在90%的最低測序深度水平進行拉平處理后計算Alpha多樣性指數(shù)，其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)為群落豐富度指數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為群落多樣性指數(shù)，4個指數(shù)計算結果如表3所示。在物種豐度上，各組間ACE指數(shù)差異不顯著，說明檳榔加工過程中不同階段的真菌豐富度差異不大；在物種多樣性上，成品籽真菌群落Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均最大，且顯著高于其他加工階段檳榔籽的真菌群落多樣性指數(shù)，說明成品籽真菌多樣性最高。

圖1 食用檳榔加工過程中真菌發(fā)現(xiàn)物種數(shù)的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of observed species in fungi community during processing of edible betelnut

2.3 食用檳榔加工過程中真菌群落Beta多樣性分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)可以從原始數(shù)據(jù)中提取出樣本之間最重要的差異。由圖2可知，第1主成分的貢獻率為 72.40%，第2主成分的貢獻率為 22.03%，其綜合差異能夠解釋全面結果的94%，可以用來解釋組間差異。洗籽、烤籽、未入蘇發(fā)籽和點鹵籽的3個樣本不論在組內還是組間都較為聚集，說明洗籽、烤籽、未入蘇發(fā)籽和點鹵籽真菌組成結構較為相似，而入蘇發(fā)籽、上膠籽、去芯籽和成品籽的組內樣本均有一定分散，且與洗籽、烤籽、未入蘇發(fā)籽和點鹵籽組間距離較遠，說明入蘇發(fā)籽、上膠籽、去芯籽和成品籽真菌組成結構與洗籽、烤籽、未入蘇發(fā)籽和點鹵籽真菌組成結構存在一定差異。

基于非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)的聚類樹分析可以觀察不同樣品間的進化距離來呈現(xiàn)不同樣品間真菌群落的相似性及差異性。由圖3可知，成品籽3個重復樣本單獨聚為一類，說明成品籽真菌群落組成與其他加工階段的檳榔樣品真菌群落組成存在較大差異。未入蘇發(fā)籽與烤籽、洗籽與點鹵籽、入蘇發(fā)籽與上膠籽真菌群落組成在聚類關系上趨同性較強，表明其真菌群落組成的親緣關系較近。

表3 食用檳榔加工過程中真菌群落 Alpha 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of fungi community during processing of edible betelnut

圖2 食用檳榔加工過程中真菌群落PCA分析Fig.2 Principal coordinate analysis of fungi community during processing of edible betelnut

圖3 食用檳榔加工過程中真菌群落UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA cluster analysis of fungi community during processing of edible betelnut

2.4 基于各分類學地位的食用檳榔加工過程中真菌組成分析

在多樣性分析的基礎上，進一步對序列進行同源性比對，由表4可知，24個樣品共鑒定出9個門，31個綱，84個目，164個科，226個屬共317種真菌，此外還有一些無法鑒定的真菌。未入蘇發(fā)籽真菌歸類為6個門，19個綱，37個目，56個科，65個屬共79種；入蘇發(fā)籽真菌歸類為7個門，24個綱，52個目，76個科，89個屬共123種；洗籽真菌歸類為6個門，20個綱，35個目，54個科，66個屬共81種；烤籽真菌歸類為7個門，22個綱，49個目，76個科，90個屬共114種；上膠籽真菌歸類為6個門，18個綱，42個目，63個科，73個屬共97種；去芯籽真菌歸類為7個門，20個綱，47個目，78個科，89個屬共117種；點鹵籽真菌歸類為7個門，19個綱，43個目，67個科，75個屬共97種；成品籽真菌歸類為8個門，22個綱，51個目，81個科，95個屬共141種。

在門水平上，檳榔加工過程中不同階段檳榔籽的真菌隸屬于9個門，其中絕對優(yōu)勢菌門為Ascomycota(子囊菌門)，其平均相對豐度達93.76%，其次除洗籽外其他加工階段檳榔籽的真菌優(yōu)勢菌門還有Basidiomycota(擔子菌門)，平均相對豐度為2.9%。在屬水平上，不同組別真菌群落組成相對豐度如圖4所示，樣品真菌隸屬于226個屬，其中優(yōu)勢菌屬包括Ascomycota(子囊菌門)的Aspergillus(曲霉屬)、Cladosporium(枝孢屬)、Candida(假絲酵母屬)、Lecanicillium(蠟蚧屬)、Simplicillium(擬青霉屬)、Penicillium(青霉屬)、Tuber(塊菌屬)、Cyberlindnera、unidentified Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis(未鑒定出的發(fā)菌)和unidentified Saccharomycetales(未鑒定出的酵母)，以及Basidiomycota(擔子菌門)的Rhodotorula(紅酵母屬)、Cutaneotrichosporon和unidentified Malasseziales(未鑒定出的馬拉色菌)。Ascomycota(子囊菌門)的Aspergillus(曲霉屬)為所有樣品中的優(yōu)勢屬，平均相對豐度為80.98%。未入蘇發(fā)籽真菌屬65個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)、Rhodotorula(紅酵母屬)、Lecanicillium(蠟蚧屬)和Tuber(塊菌屬)，相對豐度分別為82.99%、3.01%、1.20%和1.19%；入蘇發(fā)籽真菌屬89個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)和Cladosporium(枝孢屬)，相對豐度分別為74.87%和19.64%；洗籽真菌屬66個和烤籽真菌屬90個，優(yōu)勢菌屬均為Aspergillus(曲霉屬)，相對豐度分別為97.67%和91.88%；上膠籽真菌屬73個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)、Cladosporium(枝孢屬)和Candida(假絲酵母屬)，相對豐度分別為73.19%、15.05%和1.83%；去芯籽真菌屬89個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)、Candida(假絲酵母屬)、Lecanicillium(蠟蚧屬)、Simplicillium(擬青霉屬)和Cutaneotrichosporon，相對豐度分別為68.62%、1.07%、2.50%、2.45%和1.74%；點鹵籽真菌屬75個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)、Candida(假絲酵母屬)和Rhodotorula(紅酵母屬)，相對豐度分別為91.93%、1.78%和1.06%；成品籽真菌屬95個，優(yōu)勢菌屬為Aspergillus(曲霉屬)、Cladosporium(枝孢屬)、Candida(假絲酵母屬)、Penicillium(青霉屬)、unidentified Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis(未鑒定出的發(fā)菌)、unidentified Saccharomycetales(未鑒定出的酵母)、unidentified Malasseziales(未鑒定出的馬拉色菌)和Cyberlindnera，相對豐度分別為66.70%、2.52%、3.24%、1.93%、2.02%、1.15%、1.40%和1.37%。

表4 食用檳榔加工過程中真菌組成各分類地位數(shù)量Table 4 The number of identifiable units at different taxonomical levels

圖4 食用檳榔加工過程中真菌屬水平上的相對豐度Fig.4 The relative abundance of different samples at genus level

圖5 LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis

通過LEfSe分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，檳榔加工8個過程中有顯著差異的真菌類群為27個(P<0.05)。未入蘇發(fā)籽真菌群落差異關鍵菌群有4個，均隸屬于Basidiomycota(擔子菌門)的Microbotryomycetes(微球黑粉菌綱)；入蘇發(fā)籽真菌群落差異關鍵菌群有4個，均隸屬于Ascomycota(子囊菌門)的Dothideomycetes(座囊菌綱)；洗籽真菌群落差異關鍵菌群有6個，均隸屬于Ascomycota(子囊菌門)的Eurotiomycetes(散囊菌綱)；去芯籽真菌群落差異關鍵菌群有7個，包括隸屬于Ascomycota(子囊菌門)的Sordariomycetes(子囊菌綱)和隸屬于Basidiomycota(擔子菌門)的Agaricomycetes(傘菌綱)；成品籽菌群落差異關鍵菌群有6個，包括隸屬于Ascomycota(子囊菌門)的Sordariomycetes(子囊菌綱)、Eurotiomycetes(散囊菌綱)和Saccharomycetes(酵母菌綱)；烤籽、上膠籽和點鹵籽真菌群落則未發(fā)現(xiàn)差異關鍵菌群。

3 討論

隨著人們生活水平不斷提高，食品安全問題逐漸成為人們關注的重點。食用檳榔作為廣泛流行的休閑食品，其易霉變的質量安全問題亟需解決。因此為了設計有效的防控方案并提供一定的理論支持，本研究比較了食用檳榔不同加工過程中的真菌群落組成。PCA分析及UPGMA聚類分析表明，未入蘇發(fā)籽、洗籽、烤籽和點鹵籽較為聚集，真菌組成分析可知其真菌組成以檳榔內生真菌為主，說明檳榔發(fā)制過程的前期階段，加工過程中微生物污染情況不嚴重，而在清洗階段和烤籽階段能一定程度減少微生物數(shù)量，鹵水中的防腐劑也能在一定程度上抑制微生物生長，但對檳榔內生真菌影響均不大。加入蘇打釋放檳榔功效成分檳榔堿和檳榔次堿的發(fā)制后期由于發(fā)制周期過長容易引起微生物增殖和污染，從而增加真菌多樣性，上膠、去芯和包裝階段因為工藝復雜冗長，還有大量人工操作的生產(chǎn)形式從而增加了微生物污染的概率，此外切籽去芯階段檳榔內生真菌釋放且隨著加工進程繁殖增加，因此入蘇發(fā)籽、上膠籽和去芯籽的真菌組成結構差異較大，最終成品籽的真菌組成結構最豐富、多樣性最高。

Aspergillus(曲霉屬)作為檳榔果內生真菌[24]，在檳榔鮮果干制成原籽后依然存在[25-26]，且隨著貯藏時間的延長急劇增加[27]，在檳榔發(fā)制籽和成品籽中也曾培養(yǎng)分離到Aspergillus(曲霉屬)[28-29]。本研究也表明，檳榔整個加工過程中的絕對優(yōu)勢污染真菌是Aspergillus(曲霉屬)，說明在整個檳榔加工過程中檳榔內生真菌Aspergillus(曲霉屬)的存活率始終較高，極易造成檳榔籽的霉變，且由Aspergillus(曲霉屬)真菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素作為致癌劇毒物質[30]，也極大地影響著食用檳榔的安全性。

因此，為解決食用檳榔質量安全最主要的真菌污染問題，一是需要從工藝及機械化方面考量，減少生產(chǎn)過程中微生物污染問題；二是需要加大微生物防控技術研究，解決微生物尤其是檳榔內生真菌的污染問題。

4 結論

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術對食用檳榔加工過程中檳榔籽真菌結構和多樣性進行分析，Alpha 多樣性分析表明，檳榔不同加工過程中真菌豐富度差異不大，但多樣性存在一定差異，其中成品籽多樣性最高；Beta多樣性分析表明，未入蘇發(fā)籽、洗籽、烤籽和點鹵籽真菌組成結構較為相似，入蘇發(fā)籽、上膠籽和去芯籽真菌組成結構差異較大，成品籽的真菌組成結構與其他加工階段檳榔籽差異最大；經(jīng)分類學分析，用檳榔加工過程中檳榔籽共發(fā)現(xiàn)9個門，31個綱，84個目，164個科，226個屬，520個OTU，其中檳榔內生菌Aspergillus(曲霉屬)為整個加工過程中的絕對優(yōu)勢真菌。本研究全面揭示了食用檳榔加工過程中真菌群落結構及其動態(tài)變化，可為后續(xù)食用檳榔加工防霉技術的研發(fā)提供一定的理論支持。