甜葉菊中萊苞迪苷D、萊苞迪苷A含量測定方法的優(yōu)化及應用

郭志龍 陳 任 馬 茜 孫 放 張 虹 張自萍,*

(1 寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021； 2 寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021)

隨著生活水平的不斷提高，低糖健康飲食逐漸成為人們所追求的目標，甜菊糖苷因具有高甜度、低熱量的特性引起了高度關(guān)注[1-2]。甜葉菊[Steviarebaudiana(Bertoni) Hemsl.]含有萊苞迪苷(rebaudioside，R)A、C、D、E，甜菊苷(stevioside，ST)以及杜爾可苷(dulcoside，D)A、C等多個種類甜菊糖苷[3]。由于不同種類甜菊糖苷在甜菊醇骨架上所連糖殘基種類、數(shù)量不同[4]，因此表現(xiàn)出不同的甜度和口感，其中RD、RA甜味品質(zhì)較好[5]。另外，RD和RA含量的占比是目前衡量甜葉菊品質(zhì)的主要指標之一。不同品種甜葉菊生產(chǎn)的甜菊糖苷產(chǎn)品的糖苷組成及含量不同，導致產(chǎn)品的甜味品質(zhì)也不同，因此選擇適宜的甜葉菊品種進行產(chǎn)品開發(fā)顯得極為重要。

傳統(tǒng)C18柱是一種鍵合十八烷基官能團的色譜柱，對弱極性物質(zhì)具有較好的保留能力；HSS T3色譜柱為Waters公司采用T3 bonding以及先進的封端技術(shù)獲得的一款新型C18色譜柱，極性范圍跨度大，可100%兼容水相且對極性化合物有很好的保留能力；Amide色譜柱屬親水作用液相色譜，其以強極性官能團為固定相，高比例有機相為流動相，保留機理雖與氨基鍵合相色譜柱類似，卻具有比氨基鍵合相色譜柱更長的柱壽命，也避免了氨基柱中重復性較差、柱平衡耗時長的問題[20]。由于甜菊糖苷是一類極性較強的化合物，本研究嘗試以傳統(tǒng)C18、HSS T3和Amide 3種類型色譜柱為固定相，建立并優(yōu)化適用于甜葉菊中RA、RD不同種類甜菊糖苷的HPLC分析測定方法，通過對12個扦插培育的不同品系甜葉菊中甜菊糖苷進行含量測定與分析，旨在為實際應用中選擇適宜的甜葉菊品種進行產(chǎn)品開發(fā)利用提供借鑒和指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

12個甜葉菊品系均由寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室提供，利用植物培養(yǎng)專用智能溫室(光照：自然光照；溫度：25±5℃；濕度：70%±20%)同時扦插培育，將各品系甜葉菊葉片于相同時間(2018年8月6日，開花前)分別采摘，自然陰干后，粉碎過40目篩備用。

甜菊苷(ST)、萊苞迪苷A(RA)、萊苞迪苷B(RB)、萊苞迪苷C(RC)、萊苞迪苷D(RD)標準品,純度98%，甜茶苷(rubusoside, RBS)，純度≥98%，上海甄準生物科技有限公司；萊苞迪苷E(RE)，純度Grade P，美國Chromadex公司；萊苞迪苷F(RF)，純度72.5%，杜爾可苷A(DA)、甜菊雙糖苷(steviolbioside, SB)，純度98%，日本W(wǎng)ako公司；甲醇、乙腈(色譜純)，美國Fisher公司。

1.2 主要儀器與試劑

CQ-250-DST超聲波清洗機，上海躍進醫(yī)用光學器械廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Visiprep真空固相萃取裝置，美國Supelco公司；Waters XBridge?C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters Xselect?HSS T3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters XBridge?BEH Amide色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、2695高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品溶液的制備 取0.2 g甜葉菊葉片粉末，加入5 mL 70%乙醇，于60℃水浴超聲提取30 min，2 400 r·min-1離心10 min。重復提取2次，合并上清液常壓過濾，收集濾液于45℃減壓濃縮至5 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行固相萃取(solid-phase extraction，SPE)純化處理。

參考Bovanová等[21]和Woelwer-Rieck等[22]的SPE處理方法并略做改進，具體操作如下：先用10 mL甲醇活化SPE C18小柱(Waters Sep-Pak?Vac 6cc，1 g)，然后加入5 mL水置換甲醇，取樣品溶液2.5 mL上樣，依次用5 mL水和8 mL 25%乙腈淋洗，最后加入2.5 mL 80%乙腈解析，收集解析液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

1.3.2 HPLC方法的建立及優(yōu)化

1.3.2.1 色譜柱的選擇 通過對比分析C18、HSS T3和Amide 3種不同色譜柱對甜葉菊中甜菊糖苷的分離效果，選擇確定適宜的色譜柱為固定相建立并優(yōu)化色譜分析條件。

1.3.2.2 色譜分析條件的建立及優(yōu)化 在1.3.2.1試驗結(jié)果的基礎上確定適宜的色譜柱為固定相，摸索建立甜葉菊中甜菊糖苷含量測定的色譜分析條件，并對流動相組成、柱溫、洗脫方式、流速等色譜條件進行優(yōu)化，從而確定適用于甜葉菊中甜菊糖苷分離測定的HPLC方法。

1.3.2.3 色譜分析方法學評價

(1)線性關(guān)系。依次配制100、500、1 000、3 000、6 000 μg·mL-1濃度梯度的RA標準品溶液；93.75、187.50、375.00、750.00、1 500.00 μg·mL-1濃度梯度的ST標準品溶液；187.5、375.0、750.0、1 500.0、3 000.0 μg·mL-1濃度梯度的RC標準品溶液；135.94、271.88、543.76、1 087.50、2 175.00 μg·mL-1濃度梯度的RF標準品溶液，之后進行HPLC分析；依次配制31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1濃度梯度的RD標準品溶液，之后進行HPLC分析。

(2)精密度。取甜菊糖苷混合標準品溶液分別在色譜柱上重復進樣5次，以峰面積計算RA、ST、RF、RC、RD甜菊糖苷的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)。

(3)重復性。分別取0.2 g甜葉菊葉粉末共6份，平行制備6份樣品溶液，進行HPLC分析，以峰面積計算各甜菊糖苷組分的RSD。

(4)穩(wěn)定性。取甜菊糖苷樣品溶液，分別于4℃放置0、4、8、12、24 h后進行HPLC分析，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

(5)準確度。分別取0.2 g甜葉菊樣品粉末共5份，平行制備5份樣品溶液，分別添加適量的RA、ST、RC、RF、RD標準品溶液后進行HPLC分析，計算各甜菊糖苷的平均回收率。

(6)檢測限和定量限。依次取RA、ST、RC、RF、RD標準品溶液進行HPLC分析，測其保留時間處的響應值與基線噪音值，計算信噪比，以信噪比約為3∶1時的濃度作為檢測限，以信噪比約為10∶1時的濃度作為定量限。

1.3.3 不同品系甜葉菊中甜菊糖苷含量測定與分析 取12個品系甜葉菊葉粉末各0.2 g，按1.3.1方法制備樣品溶液，依次進行HPLC分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2016 進行試驗數(shù)據(jù)的整理和計算，采用Empower 2軟件以及GIMP 2軟件進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC方法的建立及優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的確定 本試驗首先參照GB 8270-2014[11]中HPLC條件考察了傳統(tǒng)反向C18色譜柱對RA的分離能力，結(jié)果表明，RA標準品(圖1-A)與甜葉菊中RA(圖1-B)均不能在C18色譜柱上與ST基線分離，表明C18色譜柱對甜菊糖苷的選擇性較差，不適用于測定甜葉菊中的RA。

為改善RA的分離效果，選擇了對極性化合物保留能力比較強的新型反向HSS T3色譜柱，結(jié)果表明，RA標準品(圖1-C)以及甜葉菊中RA(圖1-D)均能在HSS T3色譜柱上與ST基線分離，而且色譜峰整體分離度也優(yōu)于C18色譜柱，解決了C18色譜柱上RA和ST分離度差的問題，表明HSS T3色譜柱可用于測定甜葉菊中的RA。

圖1 RA、ST標準品以及甜葉菊中RA、ST在C18(A、B)色譜柱和HSS T3(C、D)色譜柱上的HPLC效果Fig.1 HPLC chromatograms of RA, ST in reference standard and Stevia rebaudiana Bertoni on C18 (A, B) and HSS T3 (C, D) columns

進一步試驗發(fā)現(xiàn)HSS T3色譜柱可同時分離RA、ST、RF、RC、DA、RBS、RB、SB 8種標準物(圖2-A)，還可同時分離甜葉菊中RA、ST、RF、RC、RBS、RB、SB 7種甜菊糖苷(圖2-B)。

但RD在HSS T3柱上的分離效果并不理想，RD出峰時間過于靠前，不僅標準品RD、RE之間分離度較差(圖3-A)，而且由于甜葉菊中RD含量較低，雜峰干擾嚴重(2～4 min)，無法采用HSS T3對甜葉菊中的RD含量進行測定(圖3-B)。

Amide為一種親水作用色譜(hydro philic interaction liquid chromatography, HILIC)模式的色譜柱，其保留機理與傳統(tǒng)正相液相色譜類似，通過試驗發(fā)現(xiàn)Amide柱上不僅可以避免標準品RD和RE間分離度較差的問題(圖3-C)，而且甜葉菊中RD也可與其他雜質(zhì)成分達到基線分離(圖3-D)。因此，后續(xù)試驗采用Amide色譜柱對甜葉菊中RD含量進行測定。

Note：1: RA. 2: ST. 3: RF. 4: RC. 5: DA. 6: RBS. 7: RB. 8: SB.圖2 多個種類甜菊糖苷標準品(A)和甜葉菊(B) 在HSS T3柱上的HPLC效果Fig.2 HPLC chromatograms of various steviol glycosides referencestandards (A) and Stevia rebaudiana Bertoni (B) on HSS T3 column

2.1.2 色譜分析條件的確定 對比分析C18、HSS T3、Amide 3種色譜柱對甜葉菊中甜菊糖苷的分離效果，選擇HSS T3和Amide色譜柱為固定相，通過對流動相組成、柱溫、洗脫方式、流速等色譜條件進行優(yōu)化，確定甜葉菊中甜菊糖苷類化合物的色譜分析條件為：

以HSS T3色譜柱為固定相，乙腈∶0.01%磷酸=32∶68(v∶v)為流動相，等度洗脫，柱溫40℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL·min-1，采用該HPLC方法可對甜葉菊中RA、ST、RF、RC、RBS、RB、SB 7種甜菊糖苷進行檢測分析。

以Amide色譜柱為固定相，乙腈∶水=76∶24(v∶v)水為流動相，等度洗脫，柱溫40℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，采用該HPLC方法對甜葉菊中RD進行檢測分析。

2.1.3 色譜分析方法學評價 以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，得RA回歸方程為y=1 419.2x+133 826，r=0.999 1，線性范圍100.00～6 000.00 μg·mL-1；ST回歸方程為y=2 437.9x+44 502，r=0.999 5，線性范圍93.75～1 500.00 μg·mL-1； RC回歸方程為y=530.49x-6 288.8，r=0.999 7，線性范圍187.50～3 000.00 μg·mL-1；RF回歸方程為y=1 745.6x+ 3 933.9，r=0.999 4，線性范圍135.94～2 175.00 μg·mL-1；RD回歸方程為y=456x+6 511.1，r=0.999 7，線性范圍31.25～500.00 μg·mL-1， 結(jié)果表明該色譜分析條件下RA、ST、RC、RF、RD的線性關(guān)系良好。

由表1可知，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD值均小于3%，表明該色譜分析條件精密度、重復性、穩(wěn)定性良好；該色譜分析條件準確度良好。經(jīng)測定分析，RA、ST、RC、RF、RD的檢測限依次為30.00、25.33、56.85、41.78、9.98 μg·mL-1，RA、ST、RC、RF、RD的定量限依次為100.00、93.75、187.50、135.94、31.25 μg·mL-1。

2.2 不同品系甜葉菊中甜菊糖苷含量測定與分析

采用以HSS T3色譜柱和Amide色譜柱分別為固定相的HPLC方法對12個扦插培育的不同品系甜葉菊中甜菊糖苷進行分析測定。由表2可知，12個品系中均含有RA、ST、RF、RC；編號為1、2、3、4、5、6、7、8、10的9個品系中含有RD；編號4、6、9、10中含有DA；編號1、3、5、7中含有RB；編號2、3、5、6、7、8、11中含有SB；含有RBS的只有編號5和編號10兩個品系，在12個品系中均未檢測出RE。表明不同品系甜葉菊所含甜菊糖苷種類有所差異。

表1 精密度、重復性、穩(wěn)定性以及準確度試驗結(jié)果Table 1 The result of precision, repeatability, stability and accuracy /%

表2 12個甜葉菊品系中所含甜菊糖苷種類Table 2 The species of steviol glycosides in 12 different Stevia rebaudiana Bertoni strains

對12個甜葉菊品系中含量相對較多的RA、ST、RF、RC、RD進行定量分析，由表3可知，12個不同品系中甜菊糖苷總量介于63.36～167.31 mg·g-1之間，其中RA含量介于23.10～113.22 mg·g-1之間，ST含量介于1.47～40.13 mg·g-1之間，RC含量介于5.44～31.57 mg·g-1之間，RF含量介于4.22～15.40 mg·g-1之間，RD含量介于0～10.28 mg·g-1之間。

甜葉菊中的RD占比、RA占比以及RD+RA占比可作為衡量甜葉菊品質(zhì)的主要指標之一。編號1、8中RA+RD占比較高，RA+RD占比分別為73.60%和73.69%，RA占比分別為66.14%、63.92%，RD占比分別為7.46%、9.77%，提示以編號1和8的甜葉菊品系為材料生產(chǎn)甜菊糖苷產(chǎn)品甜味品質(zhì)較好；編號為11、7、5、3的4個品系中甜菊糖苷總量及RA占比較高，甜菊糖苷總量分別為167.31、145.88、153.71、140.71 mg·g-1， RA含量分別為113.22、101.18、100.06、95.16 mg·g-1， RA占比分別為67.67%、69.36%、65.10%、67.63%；編號2、8、1甜葉菊品系中RD含量較高，分別為10.28、8.02、5.40 mg·g-1，且RD占比分別為16.22%、9.77%、7.46%，以編號2甜葉菊品系中RD含量及占比最高，說明以編號2的甜葉菊品系為原材料可生產(chǎn)高含量的RD。綜上，12個扦插培育的不同品系甜葉菊中RD、RA含量組成有較大差異，實際產(chǎn)生中應根據(jù)需要選擇適宜的甜葉菊品種加以應用。

3 討論

表3 12個甜葉菊品系中所含甜菊糖苷含量Table 3 The contents of steviol glycosides in 12 different Stevia rebaudiana Bertoni strains

不同種類甜菊糖苷甜味品質(zhì)不同，甜葉菊中以RA甜味品質(zhì)較好且含量較高[23-24]，但研究發(fā)現(xiàn)100%純度的RA仍是甜中帶有苦澀后味[25]；RD在甜葉菊中含量雖然比較少，卻具有比RA更佳的甜味品質(zhì)[26]。目前常采用酶法分子修飾[27-28]、微生物轉(zhuǎn)化[26-29]等方式增加甜菊糖苷組合物中RA、RD含量，但存在產(chǎn)物活性不明、成本高等問題。不同品種甜葉菊中所含RA、RD含量比例具有差異，通過選擇恰當品種的甜葉菊為原材料可以改善甜菊糖苷產(chǎn)品的味道，也可減少企業(yè)加工工序、提高生產(chǎn)效益。本研究比較分析了12個扦插培育的甜葉菊品系中RA、RD含量及其占比，結(jié)果提示以甜葉菊品系編號2為原材料可獲得高產(chǎn)量RD，以甜葉菊品系編號1、8為原材料生產(chǎn)的甜菊糖苷產(chǎn)品甜味品質(zhì)較好，而甜葉菊品系編號3、5、7、11富含RA且甜菊糖苷產(chǎn)量高，該結(jié)果可為實際應用中選擇適宜的甜葉菊品種提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

甜菊糖苷是一類極性比較強的化合物，本研究在C18、HSS T3、Amide 3種不同色譜柱中選擇確定Amide和HSS T3為較優(yōu)色譜柱，并以其為固定相建立2種不同的HPLC分析測定方法，結(jié)果表明，本研究所建立的HPLC方法可適用于甜葉菊中RD、RA甜菊糖苷的分析研究。12個扦插培育的甜葉菊品系中所含甜菊糖苷有所差異，編號2的甜葉菊品系中RD含量及占比高，編號3、5、7、11的甜葉菊品系中甜菊糖苷總含量較高(主要為RA)，編號1、8的甜葉菊品系中RA+RD占比較高，本研究結(jié)果可為實際應用中選擇適宜的甜葉菊品種進行產(chǎn)品開發(fā)利用提供借鑒和指導。