蛋黃油的提取及其氧化產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

陳伊凡 唐宏剛 李歡歡 張 晉 朱冬榮 姚云昕 陳黎洪,*

(1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021； 2 浙江艾格生物科技股份有限公司，浙江 長興 313100)

蛋黃油(yolk oil)通常是以雞蛋黃為原料，經(jīng)過提取分離制得的紅棕色油狀液體，低溫時凝固成棕黃色固體。蛋黃油富含磷脂、脂肪酸、膽固醇、高密度脂蛋白和維生素等，營養(yǎng)價值豐富[1]。蛋黃油還具有良好的藥理活性，如抗氧化、降血脂和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等[2-4]，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將蛋黃油用于治療燒燙傷、凍傷以及消化道疾病等[5-6]。此外，蛋黃油因富含卵磷脂和不飽和脂肪酸等也被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域[7-8]。

蛋黃油的制備方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2萃取法和酶法等。溶劑提取法主要用丙烷、氯仿、乙醇等溶劑提取，但丙烷提取的蛋黃油中磷脂含量較低[9]，氯仿本身具有一定毒性，因此以乙醇提取法最為常用，該方法成本低，適宜大量生產(chǎn)但存在溶劑殘留、得率低等問題[10]。超臨界CO2萃取法的研究大多在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，這種方法得率高且無污染，但對設(shè)備要求高且成本相對昂貴，因而難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[11-13]。也有研究將超臨界CO2萃取與醇提法相結(jié)合提取蛋黃油[14]。酶法是一種提取油脂的新方法，工藝簡單，污染率小，但這種方法得到的提取物主要由中性甘油三酸酯構(gòu)成，脂肪酸組分含量較高[15-16]。而干餾法、蒸餾法等得到的產(chǎn)物由于需要高溫制備，且易產(chǎn)生致癌物苯并芘[5]，具有一定安全隱患，不適宜規(guī)?；a(chǎn)。

商品蛋雞由于在產(chǎn)蛋末期的產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降而被淘汰，淘汰蛋雞屠宰后通常會遺留許多卵泡。目前，由于卵泡回收機(jī)制與深加工技術(shù)缺失，卵泡的內(nèi)在附加值未得到充分利用。然而卵泡與蛋黃十分類似，含有豐富的營養(yǎng)素，如磷脂、類甾醇、多不飽和脂肪酸等[17-18]，因此如果將卵泡加以利用不僅可以提升蛋雞副產(chǎn)物卵泡的附加值，而且有利于保護(hù)環(huán)境和節(jié)約資源。

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所畜產(chǎn)品加工課題組前期研究了卵泡中卵磷脂的高效提取[19]以及膽固醇脫除技術(shù)[20]。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提取低膽固醇蛋黃油，從而建立卵泡中系列活性物質(zhì)的綠色聯(lián)提技術(shù)。同時在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)提取產(chǎn)物具有獨(dú)特的香氣，尤其在加熱過程中產(chǎn)生濃郁的蛋黃香味。因此，將該蛋黃油進(jìn)行一定的氧化調(diào)控來豐富其香氣成分，提高風(fēng)味品質(zhì)，這在調(diào)味料和風(fēng)味食品配料中具有極大的應(yīng)用潛力。但目前關(guān)于雞蛋揮發(fā)性成分的研究主要集中在全蛋、蛋黃或蛋清上[21-25]，對蛋黃油的風(fēng)味研究較少。因此，本研究結(jié)合前期建立的氧化調(diào)控制備香精配料技術(shù)，并將提取的卵泡蛋黃油進(jìn)行氧化調(diào)控并通過氣相離子遷移色譜(gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS)測定其揮發(fā)性成分，以期明確氧化蛋典油的風(fēng)味組成，提高其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞卵泡，購于本地農(nóng)貿(mào)市場，平均重量為7.5 g，真空冷凍干燥后粉碎放入-18℃?zhèn)溆谩＆?環(huán)糊精，江蘇豐園生物技術(shù)有限公司；無水乙醇(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。雞卵泡的基本成分測定結(jié)果見表1。其中水分含量測定參照GB 5009.3-2016[26]，蛋白質(zhì)含量測定根據(jù)GB 5009.5-2016[27]，脂肪含量測定參照GB 5009.6-2016[28]，灰分含量測定參照GB 5009.4-2016[29]，磷脂含量測定按照GB/T 5537-2008[30]。

表1 雞卵泡的基本成分Table 1 Basic components of follicles

1.2 儀器與設(shè)備

ALB-224 型電子分析天平，賽多利斯學(xué)科儀器(北京)有限公司；DF-101S磁力攪拌器，上海力辰西邦儀器科技有限公司；DK-S26 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LXJ-IIB型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Flavour Spec氣相離子遷移譜風(fēng)味分析儀，德國G.A.S 公司；Scientz-18N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝凍干設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵泡中蛋黃油的提取工藝 參照文獻(xiàn)[19-20]的提取工藝，先稱取一定量的雞卵泡加入95%乙醇(m∶v)，恒溫25℃磁力攪拌25 min后，4 800 r·min-1離心20 min，上層濾液為卵磷脂，收集濾渣自然晾干后加適量水稀釋攪拌，升溫至60℃后加入β-環(huán)狀糊精(卵泡質(zhì)量的15%)攪拌1 h，冷卻至5℃后4 800 r·min-1離心25 min，所得沉淀為膽固醇，上層濾液為含蛋黃油的卵泡液。將上層濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至表面無水分，加入一定體積的無水乙醇，離心后恒溫提取、旋蒸濃縮(乙醇回收利用)得到濃稠的蛋黃油液體，最后將蛋黃油置于烘箱中干燥，稱重。 按照公式計算蛋黃油得率：

(1)

式中，M為濃縮至無水分的卵泡液提取前的總質(zhì)量，g；m為提取后濃縮干燥的蛋黃油質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 分別以提取時間1 h、料液比1∶10、 無水乙醇、提取溫度80℃為固定水平，考察各因素水平對蛋黃油得率的影響。其中，溫度分別設(shè)為65、70、75、80、85℃，時間設(shè)為45、50、55、60、65 min，料液比設(shè)為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，乙醇濃度設(shè)為75%、80%、85%、90%、95%。

1.3.3 正交試驗(yàn) 為研究各因素對蛋黃油提取效果的綜合影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)和乙醇濃度(D)為考察因素，以蛋黃油得率為評價標(biāo)準(zhǔn)，采用L9(34)正交試驗(yàn)分析法分析各因素對提取工藝的影響，確定蛋黃油提取的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平見表2。

測定最優(yōu)工藝條件下蛋黃油的基本成分，其中游離脂肪酸測定參照GB 5009.168—2016[31]。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 蛋黃油的氧化 將經(jīng)最佳提取工藝提取后經(jīng)過旋蒸濃縮的低膽固醇蛋黃油裝入加有電動攪拌器、溫度計、空氣導(dǎo)入管和回流冷凝器的容器中，當(dāng)油浴溫度達(dá)到110℃左右時通入空氣，進(jìn)行氧化反應(yīng)。反應(yīng)2.5 h后，制得氧化蛋黃油。

1.3.5 蛋黃油和氧化蛋黃油的揮發(fā)性成分測定 將頂空進(jìn)樣瓶中的樣品進(jìn)行孵化，使用加熱的進(jìn)樣針抽取瓶內(nèi)的頂空組分，采用GC-IMS分析其揮發(fā)性組分。

測定條件：頂空孵化溫度60℃；孵化時間15 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r·min-1；頂空進(jìn)樣針溫度85℃；進(jìn)樣量500 μL，不分流模式；清洗時間0.50 min；載氣為高純氮?dú)?純度≥99.999%)；色譜柱溫度60℃；色譜運(yùn)行時間20 min，設(shè)置程序流速2.00 mL·min-1并保持2 min，在20 min內(nèi)線性增至100.00 mL·min-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013制圖。氧化蛋黃油測試數(shù)據(jù)采用儀器配套的LAV(laboratory analytical viewer)分析軟件進(jìn)行定量分析，GC-IMS Library Search通過內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。LAV 中的Reporter 和Gallery Plot插件用于比較不同樣品間揮發(fā)性有機(jī)物的圖譜差異；Dynamic PCA插件用于樣品的聚類分析以及快速確定未知樣品的種類。采用LAV 軟件的插件Matching matrix 進(jìn)行相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取溫度對蛋黃油得率的影響 由圖1可知，當(dāng)提取溫度介于65～80℃之間時，蛋黃油得率隨著溫度的升高而增加；當(dāng)提取溫度高于80℃后其得率下降，推測溫度過高可能使蛋黃油中的一些脂類成分發(fā)生分解[32]。因此，提取溫度控制在80℃以下為宜。

圖1 提取溫度對蛋黃油得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield rate of yolk oil

2.1.2 提取時間對蛋黃油得率的影響 由圖2可知，當(dāng)提取時間介于45～55 min之間時，蛋黃油得率隨提取時間的延長而增大；之后隨著提取時間的延長蛋黃油得率略微下降并趨于穩(wěn)定。為節(jié)約成本和提高經(jīng)濟(jì)效益[33]，提取時間應(yīng)控制在55 min左右。

圖2 提取時間對蛋黃油得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield rate of yolk oil

2.1.3 料液比對蛋黃油得率的影響 由圖3可知，蛋黃油得率隨料液比的增大而上升，當(dāng)料液比為1∶12時，得率大幅度提高。

圖3 料液比對蛋黃油得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield rate of yolk oil

2.1.4 乙醇濃度對蛋黃油得率的影響 由圖4可知，蛋黃油得率隨乙醇濃度增加而增加，當(dāng)乙醇濃度為95%時蛋黃油得率達(dá)到最大。蛋黃油主要是脂溶性成分，易溶于有機(jī)溶劑，因此隨著乙醇濃度的增加，提取劑的性質(zhì)與蛋黃油相似度增加，提高了蛋黃油得率。

圖4 乙醇濃度對蛋黃油得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield rate of yolk oil

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，對蛋黃油得率影響最大的因素是乙醇濃度，其次是提取時間和料液比，影響最小的是提取溫度。蛋黃油提取最佳工藝條件為A2B2C2D2，即提取溫度80℃、提取時間55 min、料液比1∶10、乙醇濃度95%，此工藝下所得蛋黃油的基本成分見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 L9(34) orthogonal experimental results and statistical analysis

表4 蛋黃油的基本成分含量Table 4 Basic components of yolk oil

2.3 蛋黃油和氧化蛋黃油的風(fēng)味物質(zhì)定性分析

主成分分析(principal components analysis，PCA)是一種用于將樣品聚類分析，以及快速確定未知樣品種類的方法[34]。由圖5可知，蛋黃油和氧化蛋黃油的風(fēng)味差異極大，可以很好地聚為兩類。第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為93%，第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為5%，PC1與PC2的貢獻(xiàn)率之和為98%，說明對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行線性變換后，核心成分得到了有效的保留，能夠反映出樣本的總體特征。蛋黃油和氧化蛋黃油的主要差異在第一主成分。而且從圖6可以看出，蛋黃油中含有的揮發(fā)性物質(zhì)組成較單一，而氧化蛋黃油中的揮發(fā)性成分明顯更多。

圖7是蛋黃油和氧化蛋黃油的GC-IMS圖(俯視圖)，縱坐標(biāo)表示保留時間，橫坐標(biāo)表示離子遷移時間(歸一化處理)，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰(RIP峰，歸一化處理)，RIP 兩側(cè)的每個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越高，不同化合物可能由于濃度原因以單體或二聚體形式存在。通過比較保留時間和漂移時間，并從GC-IMS 庫進(jìn)行匹配從而對揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行定性。由圖7可知，樣本的特征揮發(fā)性組分能通過GC-IMS 技術(shù)很好地分離，特征譜表明蛋黃油中乙醇含量較高，且?guī)缀醪缓衅渌麚]發(fā)性成分；而氧化蛋黃油含有的揮發(fā)性成分和蛋黃油相比差異較大。

圖5 蛋黃油和氧化蛋黃油的PCA圖Fig.5 PCA analysis of yolk oil and oxidized yolk oil

圖6 蛋黃油和氧化蛋黃油的GC-IMS三維譜圖Fig.6 Three-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

圖7 蛋黃油和氧化蛋黃油的GC-IMS譜圖(俯視圖)Fig.7 Two-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

為明確對比兩類型蛋黃油中具體的差異物質(zhì)，選取所有峰進(jìn)行指紋圖譜對比(圖8)。圖8中每一行代表一個蛋黃油樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性化合物在不同蛋黃油樣品中的信號峰，由此可對每種樣品的完整揮發(fā)性化合物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異進(jìn)行分析。因蛋黃油樣品的風(fēng)味物質(zhì)未檢出，表5只顯示了氧化蛋黃油的風(fēng)味物質(zhì)定性結(jié)果。氧化蛋黃油共檢出26種揮發(fā)性物質(zhì)，其中11種未鑒定出，定性分析后識別出15種揮發(fā)性物質(zhì)，包括4種醇類、3種醛類、2種酮類、2種酯類和1種呋喃，其中苯乙酮、1-己醇和5-甲基-2-呋喃甲醇含二聚體。

3 討論

本研究結(jié)果表明，蛋黃油和氧化蛋黃油中的揮發(fā)性有機(jī)物差異較大，氧化蛋黃油中的風(fēng)味物質(zhì)較多，而蛋黃油中的乙醇含量高，其他風(fēng)味物質(zhì)較少。由于在通空氣氧化的工藝中需攪拌蛋黃油，該步驟需要蛋黃油有一定的流動性，因此前一步提取的蛋黃油中乙醇未旋蒸徹底，其殘留在一定程度上影響了分析。蛋黃油在氧化過程中會發(fā)生脂肪氧化分解反應(yīng)，其產(chǎn)物具有濃郁的蛋黃香味，在風(fēng)味香精、食品配料加工中具有應(yīng)用價值。醛類物質(zhì)由于閾值低，是重要的香氣成分。早期研究認(rèn)為2-甲基丁醛、2-甲基丙醛等醛類是蛋黃加熱后的主要揮發(fā)性組分[35-36]。Matiella等[37]分離鑒別出炒雞蛋中的醛、酮、醇等揮發(fā)性化合物，并發(fā)現(xiàn)3-甲基丁醛(異戊醛)是其中重要的風(fēng)味物質(zhì)。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)，3-甲基丁醛含量豐富，是構(gòu)成氧化蛋黃油香氣輪廓的重要風(fēng)味物質(zhì)，其能產(chǎn)生麥芽味、焙烤及水果香味。除3-甲基丁醛，己醛等醛類也豐富了氧化蛋黃油的香氣。醇類一般由脂肪氧化產(chǎn)生[38]，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大，氧化蛋黃油中有1-己醇、2,3-丁二醇、5-甲基-2-呋喃甲醇等醇類物質(zhì)。蛋黃油脂中的揮發(fā)性酮類成分主要源于油酸、亞油酸等的分解氧化[39]，本研究分析表明在氧化蛋黃油中含有較多的2-丁酮(清香味)。氧化蛋黃油中還含有苯甲醛，苯甲醛屬于芳香族化合物，含有特殊的杏仁味且閾值低。有研究表明苯甲醛在咸雞蛋蛋黃中是一種重要的揮發(fā)性物質(zhì)[40]；還有研究表明，己醛、乙酸丙酯、2-戊基呋喃等是蛋黃的關(guān)鍵氣味活性物質(zhì)[41]。在本研究中，乙酸丁酯、己醛(青草味)、2-戊基呋喃、芳樟醇(鈴蘭香氣)等也為氧化蛋黃油的風(fēng)味做出了貢獻(xiàn)。

圖8 蛋黃油和氧化蛋黃油的Gallery Plot圖(指紋圖譜)Fig.8 Fingerprints information of characteristic flavor of yolk oil and oxidized yolk oil

表5 氧化蛋黃油的特征風(fēng)味物質(zhì)定性分析信息Table 5 Qualitative information of characteristic flavor of oxidized yolk oil

4 結(jié)論

為提高蛋雞副產(chǎn)物的利用價值，本研究從雞卵泡殘?jiān)刑崛〕龅包S油并進(jìn)行氧化風(fēng)味調(diào)控。結(jié)果表明，卵泡蛋黃油提取的最優(yōu)工藝參數(shù)：提取溫度75℃，提取時間55 min，料液比1∶10，乙醇濃度95%。用GC-IMS對氧化蛋黃油的特征風(fēng)味成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要風(fēng)味物質(zhì)包括3-甲基丁醛、2-丁酮、己醛、苯甲醛、2-戊基呋喃等，其中3-甲基丁醛是特征風(fēng)味物質(zhì)。卵泡具有較高的開發(fā)價值，提高蛋雞副產(chǎn)物的利用水平能更好地提升蛋品的附加值，對行業(yè)發(fā)展具有積極作用。