川東獐牙菜體外高效再生體系的建立

于葉霞 林虎絨 王元忠 黃衡宇,* 李 鸝

(1 吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000； 2 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，云南 昆明 650500； 3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

川東獐牙菜(SwertiadavidiiFranch.)又名水靈芝、魚(yú)膽草、青魚(yú)膽草等，為龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬(Swertia)多年生草本[1]，主要分布在湖南、湖北、四川及貴州等中西部省份，為我國(guó)特有物種。川東獐牙菜多生長(zhǎng)在河邊草叢、石縫及灌木叢中[2]，其性寒、味極苦，具有清熱解毒、利膽健胃等功效。川東獐牙菜主要含有口山酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類和黃酮類等化學(xué)成分，用于治療黃疸型肝炎、痢疾、肺炎、扁桃體炎及婦科炎癥等疾病[3]。

隨著對(duì)民間草藥川東獐牙菜化學(xué)成分和藥理活性的深入研究，其已成為重要中藥資源，并作為一種珍稀藥材被《中藥志》收錄[4]。在原生地，川東獐牙菜由于植株矮小、伴生雜草極多，僅在花期易被識(shí)別。藥農(nóng)及草醫(yī)對(duì)花期植株的大量采摘導(dǎo)致川東獐牙菜無(wú)法完成生活史，有性生殖效率極低，野生種群及個(gè)體數(shù)量急劇銳減。此外，水壩、電站等人類活動(dòng)使原生地水位上升，造成川東獐牙菜主要生境被淹沒(méi)，野生資源逐漸枯竭，部分道地產(chǎn)區(qū)現(xiàn)已難覓其蹤跡。我國(guó)一些地區(qū)曾嘗試對(duì)川東獐牙菜進(jìn)行人工引種栽培，但由于缺少對(duì)其生活史、有性生殖、無(wú)性繁殖及傳粉生物學(xué)等方面的了解，成效甚微[5]。前期，課題組成員分別于2014年7月和2017年8月前往湘、黔、川等地進(jìn)行川東獐牙菜資源考察研究，發(fā)現(xiàn)僅湖南省張家界市茅巖河南岸有較大種群存在，其他傳統(tǒng)產(chǎn)地僅當(dāng)?shù)鼐用褡鳛樗幍匦∶娣e種植，每年采收種子進(jìn)行繁殖，野生資源基本喪失。據(jù)了解，此繁殖方式已持續(xù)15年之久，長(zhǎng)期近交導(dǎo)致川東獐牙菜種質(zhì)退化。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育出大量基因型一致的優(yōu)質(zhì)川東獐牙菜種苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前已有川東獐牙菜組織培養(yǎng)的研究[6]，但存在繁殖周期長(zhǎng)、增殖系數(shù)低、生根苗纖弱等問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)單因素-完全組合-正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立川東獐牙菜適宜和高效的繁殖技術(shù)體系，以期為其野生資源保護(hù)及規(guī)?；N植提供有效途徑，也為其遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期川東獐牙菜植株于2016年10—12月采自湖南省張家界市茅巖河火燒溶居群(110°16′E，29°06′N及附近，海拔150 m)，帶土移栽于湖南吉首大學(xué)生態(tài)研究所試驗(yàn)地。經(jīng)吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院標(biāo)本館張代貴高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為SwertiadavidiiFranch.(憑證標(biāo)本：黃衡宇159，存于吉首大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院標(biāo)本館)。選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害植株，取其帶葉莖尖、帶芽莖段和葉片作為外植體。

MS為基本培養(yǎng)基，瓊脂4.7 g·L-1，pH值5.4～5.8。試驗(yàn)所用激素母液質(zhì)量濃度均為0.1 mg·mL-1。

1.2 外植體的處理

外植體用自來(lái)水沖洗12 h，5%洗衣粉溶液(質(zhì)量比)浸泡5 min，自來(lái)水沖洗30 min，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%乙醇(體積比)處理10～15 s，0.1%升汞(質(zhì)量比)消毒2 min，無(wú)菌水沖洗6次，每次不少于3 min，接種于相應(yīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.3 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有優(yōu)化試驗(yàn)中，培養(yǎng)室溫度控制在22±1℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間10 h·d-1，每隔7 d記錄不同處理組的川東獐牙菜生長(zhǎng)情況。

1.3.1 單因素試驗(yàn) MS基本培養(yǎng)基中添加不同激素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，其中6-芐基腺嘌呤(6-benzylamino purine，6-BA)、6-糠氨基嘌呤(Kinetin，KT)和吲哚乙酸(β-indoleacetic acid，IAA)質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1；萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.50、1.00、1.50 mg·L-1；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)質(zhì)量濃度為0.01、0.03、0.05、0.50 mg·L-1。分別將3種外植體接種于上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后觀察各試驗(yàn)組川東獐牙菜的生長(zhǎng)情況。

1.3.2 腋芽誘導(dǎo) 基于單因素試驗(yàn)及早期研究結(jié)果[8]，用不同濃度的6-BA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)和NAA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)進(jìn)行完全組合試驗(yàn)，以帶芽莖段為外植體考察不同激素組合對(duì)川東獐牙菜腋芽誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)川東獐牙菜腋芽發(fā)生率及腋芽發(fā)生系數(shù)。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)帶芽莖段，每組接種22瓶。污染瓶不予統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 愈傷組織誘導(dǎo)、不定叢芽發(fā)生及增殖 以葉片為外植體，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交因素為6-BA(A)、NAA(B)、KT(C)，其組合見(jiàn)表1，篩選川東獐牙菜葉片愈傷組織誘導(dǎo)和不定叢芽發(fā)生的最佳激素組合。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率、叢芽發(fā)生率和增殖系數(shù)。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)葉片，每組接種22瓶。

表1 川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design L9 (34) of callus induction and shoots germination in S. davidii

1.3.4 生根培養(yǎng)試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，切取生長(zhǎng)健壯的單苗接入含不同濃度(0、0.01、0.05、0.10、0.50 mg·L-1)NAA的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)川東獐牙菜生根率。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)幼苗，每組接種22瓶。污染瓶不予統(tǒng)計(jì)。

1.4 煉苗移栽

川東獐牙菜生根培養(yǎng)30 d后，在自然光下閉口煉苗7 d，再打開(kāi)瓶蓋煉苗3 d，取出生根苗小心洗盡殘余培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈溶液(質(zhì)量比)浸泡根部5 min，移栽到沙質(zhì)土中，30 d后統(tǒng)計(jì)川東獐牙菜幼苗的成活率。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及分析

采用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 12.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析。

腋芽發(fā)生系數(shù)=出芽總數(shù)/起始接種總數(shù)

(1)

出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/起始接種總數(shù)×100%

(2)

叢芽發(fā)生率=產(chǎn)生叢芽的愈傷組織數(shù)/已產(chǎn)生愈傷的外植體總數(shù)×100%

(3)

增殖系數(shù)=有效轉(zhuǎn)接數(shù)/起始接種總數(shù)

(4)

生根率=產(chǎn)生不定根的單苗數(shù)/起始接種總數(shù)×100%

(5)

成活率=成活植株數(shù)/移栽植株總數(shù)×100%

(6)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及激素種類的選擇

結(jié)果表明，在所有激素處理下川東獐牙菜的帶葉莖尖生長(zhǎng)均不好，基本無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，僅有少量不定根出現(xiàn)，不宜作為川東獐牙菜離體培養(yǎng)材料。而各試驗(yàn)組中川東獐牙菜葉片和帶芽莖段均能生長(zhǎng)。其中，在試驗(yàn)組各水平中，葉片都能誘導(dǎo)出一定比例愈傷組織，且KT組誘導(dǎo)出的愈傷組織中有少量不定芽分化，而2,4-D組雖然能誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，但質(zhì)量較差、易老化；帶芽莖段則適合在6-BA、NAA和IAA組中生長(zhǎng)，在節(jié)上腋芽萌發(fā)后可見(jiàn)少量愈傷組織出現(xiàn)，但無(wú)不定芽分化。此外，IAA和NAA均有利于川東獐牙菜帶芽莖段節(jié)上腋芽及不定根的生長(zhǎng)，且NAA誘導(dǎo)效果尤佳。綜合分析，選擇6-BA、NAA和KT用于川東獐牙菜的離體培養(yǎng)。

2.2 直接器官發(fā)生途徑

不同激素配比對(duì)川東獐牙菜腋芽誘導(dǎo)有顯著影響(表2)。其中，第9組培養(yǎng)基中腋芽發(fā)生系數(shù)最高，與其他試驗(yàn)組相比差異顯著，且腋芽發(fā)育正常。將川東獐牙菜帶芽莖段接入該培養(yǎng)基(圖1-A)，培養(yǎng)14 d后腋芽迅速增長(zhǎng)，次級(jí)腋芽大量增殖(圖1-B)，培養(yǎng)21 d后各級(jí)腋芽進(jìn)一步生長(zhǎng)(圖1-C)，培養(yǎng)30 d后腋芽生長(zhǎng)旺盛，形成多枝多芽系統(tǒng)(圖1-D)，其腋芽發(fā)生系數(shù)可達(dá)4.06，增殖系數(shù)達(dá)3.67。上述結(jié)果表明，帶芽莖段是川東獐牙菜離體培養(yǎng)較合適的外植體材料。

表2 不同激素組合對(duì)川東獐牙菜腋芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of different hormone combinations on the axillary buds induction in S. davidii

注：A：帶芽莖段；B：培養(yǎng)14 d后腋芽；C：培養(yǎng)21 d后腋芽；D：培養(yǎng)30 d后形成多枝多芽系統(tǒng)。Note: A: Stem with buds. B: Axillary buds deriving from stem with buds in culture for 14 days. C: The growth of axillary buds in culture for 21 days. D: System of multi-branches in culture for 30 days.圖1 川東獐牙菜帶芽莖段誘導(dǎo)過(guò)程中的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics during the induction process of stem with buds in S. davidii

2.3 間接器官發(fā)生途徑

愈傷組織誘導(dǎo)極差分析與方差分析結(jié)果顯示(表3)，RA>RC>RD>RB，表明6-BA是川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)最主要的影響因子，其次為KT；2個(gè)因素極差值均大于空白列，表明它們?cè)谟鷤M織誘導(dǎo)上效應(yīng)可靠；而NAA極差值小于空白列，表明它對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)不可靠。方差分析(表4)表明，6-BA對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織有顯著性影響(P<0.05)，KT和NAA則對(duì)對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織無(wú)顯著性影響(P>0.05)。結(jié)合極差和方差結(jié)果，可以不考慮NAA對(duì)川東獐牙菜葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響。Duncan檢驗(yàn)(表5)表明，6-BA在3水平上較其他2個(gè)水平好，且有顯著性差異(P<0.05)。根據(jù)平均值分析，川東獐牙菜葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合為A3C3，即2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1KT。

叢芽發(fā)生極差分析(表3)結(jié)果為RC>RA>RD>RB，表明KT是誘導(dǎo)叢芽發(fā)生最主要的影響因子，其次是6-BA和NAA；KT和6-BA的極差值均大于空白列，表明它們?cè)趨惭堪l(fā)生上的效應(yīng)可靠，NAA則不可靠。進(jìn)一步方差分析(表4)可知，KT對(duì)叢芽誘導(dǎo)具有顯著性影響(P<0.05)，6-BA和NAA均對(duì)誘導(dǎo)叢芽無(wú)顯著性影響(P>0.05)。Duncan檢驗(yàn)(表5)表明，隨著KT濃度升高，叢芽發(fā)生率增加，在水平3上影響顯著高于水平1、2。由平均值分析可知，川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)叢芽發(fā)生的最佳激素組合為A2C3，即1.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1KT。

表3 川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of callus and shoots germination by L9 (34) orthogonal test in S. davidii

綜合愈傷誘導(dǎo)率和叢芽發(fā)生率，考慮到愈傷組織為間接器官發(fā)生的關(guān)鍵階段，故采用A3C3作為葉片愈傷組織誘導(dǎo)、不定叢芽分化和增殖同步進(jìn)行的激素組合。在此培養(yǎng)基中，葉片培養(yǎng)7 d后切口處脫分化產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)(圖2-A)；培養(yǎng)14 d后開(kāi)始分化出不定芽(圖2-B)；培養(yǎng)21 d后不定芽迅速生長(zhǎng)(圖2-C)；培養(yǎng)30 d后愈傷組織分化出大量叢芽，叢芽發(fā)生率達(dá)96.50%(圖2-D)。將材料以5～6芽為單位切開(kāi)并接入新鮮培養(yǎng)基中(圖2-E)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，叢芽不斷增殖與生長(zhǎng)(圖2-F、G)，培養(yǎng)30 d后獲得大量叢芽，其增殖系數(shù)達(dá)到8.75(圖2-H)。

表4 川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)和叢芽發(fā)生方差分析Table 4 Variance analysis of callus induction and shoots induction in S. davidii

注：A：愈傷組織；B：培養(yǎng)14 d后不定芽分化；C：培養(yǎng)21 d后不定芽生長(zhǎng)與增殖；D：培養(yǎng)30 d后不定芽大量分化；E：培養(yǎng)轉(zhuǎn)接叢芽； F：培養(yǎng)14 d后叢芽分化；G：培養(yǎng)21 d后叢芽分化與增殖；H：培養(yǎng)30 d后的叢生芽。Note: A: Callus. B: Adventitious shoots generated in culture for 14 days. C: Growth and proliferation of adventitious shoots in culture for 21 days. D: Abundant adventitious shoots were differentiated in culture for 30 days. E: Cluster shoots. F: Cluster shoots were differentiated in culture for 14 days. G: Growth and proliferation of adventitious shoots in culture for 21 days. H: Robust clustered-shoots in culture for 30 days.圖2 川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)和叢芽增殖過(guò)程中的表型Fig.2 Phenotypic characteristics during callus induction and multiple-shoots proliferation in S. davidii

2.4 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

在誘導(dǎo)不定根試驗(yàn)中(表6)，對(duì)照組(0 mg·L-1NAA)生根率僅為23.40%，顯著低于其他試驗(yàn)組，且分化出來(lái)的根短較細(xì)。在附加低濃度NAA的培養(yǎng)基上，川東獐牙菜生根率顯著提高，其生長(zhǎng)狀況良好；當(dāng)NAA濃度高于0.05 mg·L-1后，生根率隨著NAA濃度的升高而逐漸下降。川東獐牙菜誘導(dǎo)生根的最佳配方為MS + 0.05 mg·L-1NAA，生根率達(dá)到100%，且顯著高于其他處理。將生長(zhǎng)健壯的單苗接入此培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后生根苗的根系粗壯且長(zhǎng)(圖3-A、B)；煉苗后移栽成活率達(dá)90%以上(圖3-C)。

表5 不同濃度6-BA和KT的Duncan檢驗(yàn)Table 5 Duncan’ test in different concentration of 6-BA and KT

表6 不同NAA濃度對(duì)川東獐牙菜生根的影響Table 6 Effect of different NAA concentration on rooting of plantlets in S. davidii

注：A：培養(yǎng)30 d后生根苗；B：培養(yǎng)瓶底根系；C：培養(yǎng)30 d后移栽苗。Note: A: Rooting plantlets in medium after 14 days. B: Root system in bottom. C: Transplanting plantlets after 30 days.圖3 川東獐牙菜生根培養(yǎng)及移栽Fig.3 Rooting culture and transplanting in S. davidii

3 討論

3.1 川東獐牙菜不同外植體類型及其增殖途徑

植物組織培養(yǎng)中，外植體類型是影響離體培養(yǎng)效果的主要因素之一。不同植物種類，甚至同一植物不同器官對(duì)外界誘導(dǎo)的反應(yīng)及本身再分化能力均不同，因此不同外植體增殖方式與效果具有明顯差異[7-9]。在龍膽科植物中有報(bào)道采用胚軸、葉片、莖段、莖尖和根等作為外植體，胚軸[10]、葉片[11-12]、根[13]主要通過(guò)間接器官發(fā)生途徑再生；莖尖[14-15]則多以直接器官發(fā)生途徑再生；帶芽莖段[16-17]采用上述2種再生方式均有報(bào)道。本研究選取了3種外植體，其中帶葉莖尖不宜作為川東獐牙菜外植體材料，估計(jì)其莖尖頂端優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)，抑制腋芽發(fā)生，在培養(yǎng)過(guò)程僅生長(zhǎng)點(diǎn)伸長(zhǎng)最終形成不分支單株，達(dá)不到快繁的基數(shù)要求。

本研究發(fā)現(xiàn)帶芽莖段適宜于直接器官發(fā)生途徑，通過(guò)腋芽萌發(fā)和生長(zhǎng)以“微扦插”方式進(jìn)行繁殖，同時(shí)莖段基部切口處亦可產(chǎn)生少量質(zhì)地疏松的愈傷組織。與青葉膽(S.mileensis)[17]不同，川東獐牙菜帶芽莖段產(chǎn)生的愈傷組織無(wú)再分化能力，可能僅能增大外植體與培養(yǎng)基接觸面積，從而有利于培養(yǎng)外植體更有效地獲取營(yíng)養(yǎng)。

葉片是川東獐牙菜間接器官發(fā)生途徑的最佳材料。以葉片為外植體進(jìn)行體外快繁的報(bào)道很多，大多為唇形科[18-19]、茄科[20-21]及薔薇科[22-23]等草本或灌木植物，而通過(guò)葉片建立再生體系的獐牙菜屬及整個(gè)龍膽科物種并不多見(jiàn)，推測(cè)與物種所處生境有關(guān)。川東獐牙菜主要分布在河谷兩岸，氣候濕潤(rùn)、多雨、多霧。這樣的生境條件一方面導(dǎo)致葉片變厚，柵欄組織和海綿組織細(xì)胞排列疏松，組織間隙大；另一方面致使葉脈發(fā)達(dá)，其疏導(dǎo)水分的能力增加。因此，在外源激素刺激下，切口處葉脈周圍薄壁組織極易轉(zhuǎn)入脫分化狀態(tài)并迅速增殖，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地緊密、具很強(qiáng)再分化能力，一旦發(fā)生便很快分化出不定叢芽。本研究中，川東獐牙菜在此培養(yǎng)途徑中，除了愈傷組織—不定叢芽增殖方式外，隨著不定叢芽中3～5個(gè)主芽生長(zhǎng)，各級(jí)腋芽也不斷出現(xiàn)和生長(zhǎng)，最后整個(gè)培養(yǎng)物形成一個(gè)既有基部不定叢芽又有多枝多芽的簇狀叢生系統(tǒng)，其增殖系數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)已報(bào)道的本屬其他植物[17]。

3.2 川東獐牙菜不同外植體對(duì)外源激素的響應(yīng)

外源激素對(duì)植物離體再生具有重要的調(diào)控作用，不同激素種類及其濃度水平在調(diào)控細(xì)胞脫分化、增殖和生長(zhǎng)及形態(tài)建設(shè)等方面具有極其重要的影響[24-26]。本研究結(jié)果表明，在川東獐牙菜體外快速繁殖中，單因素、完全組合和正交試驗(yàn)結(jié)果都顯示激素間配合使用所產(chǎn)生的培養(yǎng)效果明顯高于單獨(dú)使用，表明多種激素之間的協(xié)同作用遠(yuǎn)大于單獨(dú)作用的效果。以帶芽莖段為材料的培養(yǎng)中，附加較高濃度的6-BA有利于腋芽增殖，但對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和再分化基本無(wú)效果，似乎僅起到促進(jìn)腋芽萌發(fā)和生長(zhǎng)的作用；而在青葉膽[11]中，6-BA對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)和再分化具有顯著效應(yīng)。初步推斷可能與川東獐牙菜生長(zhǎng)地水源充足、氣候潮濕有關(guān)，其植株莖段木質(zhì)化程度較低、輸導(dǎo)組織不發(fā)達(dá)，故對(duì)6-BA 不敏感，即使誘導(dǎo)出愈傷組織也無(wú)再分化能力。一般來(lái)說(shuō)，以葉片為材料的培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配合使用可以促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)、不定叢芽發(fā)生[27-28]。而本研究結(jié)果顯示，6-BA和KT對(duì)川東獐牙菜愈傷組織誘導(dǎo)、不定叢芽發(fā)生和增殖均有顯著效應(yīng)，NAA的誘導(dǎo)效應(yīng)并不明顯；而在印度獐牙菜(S.chirayita)[29]、青葉膽[11]等同屬植物的體外快速繁殖中，外源生長(zhǎng)素卻是誘導(dǎo)愈傷組織的重要因素。有研究指出，干旱脅迫是導(dǎo)致植物內(nèi)源生長(zhǎng)素含量低下的重要原因之一[30-32]，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。川東獐牙菜的特殊生境使其植株，特別是葉片中內(nèi)源生長(zhǎng)素積累較多，造成外源生長(zhǎng)素在其葉片離體繁殖中作用不顯著；而其他已有報(bào)道的獐牙菜屬植物生境均為少雨干旱，只能通過(guò)降低內(nèi)源生長(zhǎng)素水平，使生長(zhǎng)速率減慢，從而保證植株完成正常生理活動(dòng)，因而對(duì)外源生長(zhǎng)素產(chǎn)生較強(qiáng)烈的響應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了川東獐牙菜體外快速繁殖培養(yǎng)條件，成功建立了高效穩(wěn)定的再生體系。其中，對(duì)于帶芽莖段為材料的直接器官發(fā)生途徑，盡管其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)較低，但能最大程度維持母本基因型，可用于種質(zhì)資源保存、遺傳轉(zhuǎn)化等基礎(chǔ)研究。以葉片為材料的間接器官發(fā)生途徑，接種培養(yǎng)7 d后即可產(chǎn)生再分化能力極強(qiáng)的愈傷組織，培養(yǎng)14 d后便可產(chǎn)生不定叢芽，若及時(shí)將材料按5～6芽為單位切割，轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，可無(wú)限繁殖，每代增殖系數(shù)均達(dá)8.75，且在以后的培養(yǎng)中，無(wú)需再?gòu)挠鷤M織誘導(dǎo)開(kāi)始，極大縮短了培養(yǎng)周期，實(shí)現(xiàn)了愈傷組織誘導(dǎo)、叢芽發(fā)生和增殖的同步進(jìn)行，培養(yǎng)效率得到顯著提高，可應(yīng)用于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)。