低氮脅迫對不同光皮樺基因型苗期生長及生理生化特征的影響

程麗麗 潘 櫻 林 艷 林仕雄 童再康 張俊紅

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300)

氮素是植物生長發(fā)育不可或缺的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，在植物生命活動中具有不可替代的作用，是影響植物生產(chǎn)和質(zhì)量的關(guān)鍵因素[1-2]。氮代謝途徑紊亂會對植物生長與形態(tài)造成不利影響，顯著影響植物根系發(fā)育、葉綠素含量及種子產(chǎn)量等[3]。施用氮肥可促進農(nóng)作物增產(chǎn)，但隨著氮肥施用量增加其利用效率逐年降低，同時造成農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降、生產(chǎn)成本提高和生態(tài)環(huán)境惡化等問題[4-5]。因此，利用植物自身遺傳變異，挖掘植物本身利用養(yǎng)分的潛力，篩選和培育耐低氮、氮高效利用的新品種是解決這些問題的理想途徑之一[6]。

光皮樺(Betulaluminifera)為樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula)落葉喬木，是我國特有的優(yōu)良速生用材樹種[7]。光皮樺材質(zhì)優(yōu)良、用途廣、病蟲害少，是近年來我國南方山區(qū)大力發(fā)展的重要用材樹種[8]。然而，由于南方山區(qū)土壤中可利用氮源較少，缺氮成為影響光皮樺生產(chǎn)的重要因素。研究表明，植物可感知外界逆境脅迫信號，通過自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)在生理和形態(tài)上產(chǎn)生響應(yīng)，以增強在脅迫條件下的生存機會[9-10]，且植物不同基因型在礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用方面存在顯著的遺傳差異[11]。目前對植物不同基因型氮素利用差異的研究主要集中于小麥(Triticumaestivum)[1]、玉米(Zeamays)[12]、大麥(Hordeumvulgare)[4]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[13]等農(nóng)作物，關(guān)于林木氮生理效率的遺傳和育種研究較少。樊瑞懷等[14]研究不同基因型馬褂木(Liriodendronchinense)的氮素脅迫響應(yīng)，將參試家系劃分為穩(wěn)定型高氮效率家系和敏感型低氮效率家系兩大類，并結(jié)合不同氮素下的生長表現(xiàn)進一步分為生長優(yōu)良和生長劣勢家系。Luo等[15]研究發(fā)現(xiàn)速生楊群眾楊(Populuspopularis)和慢生楊銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)在低氮脅迫下根表型和光合作用等響應(yīng)存在顯著差異，速生楊的氮代謝在低氮條件下較慢生楊更敏感。Zhang等[16]研究表明低氮脅迫對青楊(P.cathayana)雌株影響比雄株更大，低氮脅迫下雄株葉綠素含量、氮生理利用效率、谷氨酸脫氫酶和過氧化氫酶活性比雌株更高，且葉綠素超顯微結(jié)構(gòu)更完整。

本研究以3個光皮樺基因型為試驗材料，通過正常供氮和低氮脅迫分別處理水培光皮樺幼苗，分析不同光皮樺基因型在低氮脅迫下的生長和生理生化指標變化，探索光皮樺適應(yīng)低氮環(huán)境的生理機制，以期為耐低氮脅迫種質(zhì)的篩選和培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用浙江農(nóng)林大學(xué)珍貴樹種育種課題組前期篩選的光皮樺G49-3、G50-1和優(yōu)3三個基因型的組培苗為供試材料。組培苗繼代于1/2 MS固體培養(yǎng)基，2月苗齡時移植至基質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1)，培養(yǎng)30 d后移入水培裝置，適應(yīng)培養(yǎng)30 d。水培條件為：白天25℃，晚上20℃，16 h光/8 h暗，光照強度120 μmol·m-2·s-1。 試驗前將試驗材料饑餓處理7 d，期間以超純水培養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗基地人工培養(yǎng)室進行?；谇捌诓煌獫舛鹊脑囼灱拔墨I[8]選取NO3-濃度。Hoagland營養(yǎng)液配制參照Georgieva[17]的方法，正常供氮組(control，CK)NO3-濃度為15 mmol·L-1； 低氮脅迫組(low nitrogen，LN)NO3-濃度為0.03 mmol·L-1，缺失的K+以濃度為4.97 mmol·L-1KCl補齊，配方參照文獻[18]。本試驗采用裂區(qū)試驗設(shè)計，氮素處理為主區(qū)(A)：CK(A1)和LN(A2)；基因型為副區(qū)(B)：G49-3(B1)、G50-1(B2)和優(yōu)3(B3)，均按完全隨機區(qū)組排列，重復(fù)5次。

光皮樺苗處理21 d后于當(dāng)日上午11時對每個基因型幼苗取樣，測定3個基因型植株的株高、葉片和根系表型，葉綠素含量，過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和硝酸還原酶(nitric reductase，NR)活性等指標。并分別取各基因型的根和葉經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱，備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生物量、葉綠素含量和氮含量測定 將植株從水培裝置中取出，從根基部切斷，將植株分為地上部和根部，測定株高，并掃描根系。然后分別將地上部和根放入烘箱105℃殺青30 min，再75℃烘干至恒重并記錄。葉綠素含量測定采用丙酮-乙醇直接浸漬法[19]，于663、645 nm波長處測定吸光度值，代入公式計算(Ca=12.71×A663-2.59×A645，Cb=22.88×A645-4.67×A663，C=8.04×A663+20.29×A645，以mg·g-1表示)。樣品經(jīng)H2SO4-H2O2消煮，利用微量凱氏定氮法[19]測定氮含量。

1.3.2 根系結(jié)構(gòu) 采用平板掃描儀Epson Perfection V700(RZGENT公司，加拿大)以800 dpi分辨率采集根系圖像，并利用WinRhizo根系分析系統(tǒng)分析總根長、根系總表面積等根系形態(tài)指標。

1.3.3 POD、SOD和NR活性測定 葉片POD和SOD活性分別采用過氧化物酶測定試劑盒(比色法[19])和總超氧化物歧化酶測試盒(羥胺法[19])測定，POD及SOD活性均以U·g-1FW表示。NR活性采用硝酸還原酶測定試劑盒測定，以μg· g-1·h-1FW表示。上述試驗所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.4 硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達分析 采用CTAB+Trizol法分別提取光皮樺根和葉總RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]反轉(zhuǎn)錄進行cDNA第一鏈合成。采用StepOne Real-Time PCR system (Applied Biosystem，美國) 進行RT-qPCR，反應(yīng)體系(10 μL)：SYBR premix ExtaqⅡ 5.0 μL、Primer-F 0.4 μL、Primer-R 0.4 μL、cDNA 0.5 μL和ddH2O 3.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)39次；65～95℃作熔解曲線。RT-qPCR所用引物見表1，參考前期光皮樺內(nèi)參基因篩選結(jié)果，選擇 large ribosomal subunit 39 (RPL39)作為內(nèi)參基因(GenBank 登錄號: KP245805)[8]。

表1 光皮樺硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因引物Table 1 Primers for nitrate transporter genes in B. luminifera

1.3.5 隸屬函數(shù)的計算方法 耐低氮系數(shù)K=低氮處理測定值/對照測定值。耐低氮綜合評價采用隸屬函數(shù)法綜合各項指標進行評價[20-21]，其計算公式為:

式中，i表示某個基因型；j表示某項指標；Uij表示i基因型j指標的隸屬函數(shù)值；Xjmin表示各基因型j指標耐低氮系數(shù)最小值；Xjmax表示各基因型j指標的耐低氮系數(shù)最大值。將各基因型所有性狀的隸屬函數(shù)值進行累加，求其平均值得各基因型的隸屬函數(shù)值Ui，Ui值越大表示耐低氮能力越強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Office Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS18.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對不同基因型光皮樺幼苗的表型及葉綠素含量的影響

在CK和LN條件下處理21 d后，3個基因型光皮樺幼苗形態(tài)上發(fā)生變化。LN各基因型光皮樺幼苗不定根數(shù)量明顯增多，葉色發(fā)黃(圖1)，尤其嫩葉黃化，葉片較小，呈典型缺氮表型(圖2-a)。LN不同基因型光皮樺的葉綠素總量、葉綠素a和葉綠素b含量均顯著降低(圖 2-b～d)，且在不同基因型光皮樺間存在極顯著差異。

圖1 低氮脅迫處理21 d后3種基因型光皮樺的表型Fig.1 The phenotypes of three genotypes in B. luminifera after 21 days of treatment under LN stress

2.2 低氮脅迫對不同基因型光皮樺幼苗生長的影響

由表2可知，與CK相比，LN各基因型光皮樺的株高、地上部干重、地上氮含量和氮積累量均呈下降趨勢，且不同基因型間存在極顯著差異，表明低氮脅迫對不同基因型光皮樺生長的抑制程度不同，其中G49-3的株高和地上部干重的降幅達到顯著或極顯著水平，表明G49-3對低氮更敏感。3種基因型光皮樺地上氮含量和氮積累量下降均達到顯著或極顯著水平，且均是G49-3降幅最大，G50-1降幅最小，表明G50-1氮含量和氮積累量受低氮脅迫影響較小，表現(xiàn)出較強耐低氮能力，而G49-3對低氮脅迫更敏感。

表2 低氮脅迫下3種基因型光皮樺地上部生長的差異Table 2 Differences in shoot growth of three genotypes in B. luminifera under LN stress

注：a: 光皮樺葉色比較，從頂端向下的第二、第三片葉子。 *表示相對于CK，LN達顯著水平(P<0.05)，** 表示達極顯著水平(P<0.01)。下同。Note: a: Comparison of leaf color in B. luminifera with the second and third leaves from the top. * indicates that LN has a significant level relative to CK(P<0.05), ** indicates a extremely significant level(P<0.01). The same as following.圖2 低氮脅迫下三種基因型光皮樺的葉色比較及葉綠素含量分析Fig.2 Comparison of leaf color and chlorophyll content of three genotypes in B. luminifera under LN stress

2.3 低氮脅迫對不同基因型光皮樺幼苗根系的影響

由表3可知，與CK相比，LN處理下3種基因型光皮樺的地下氮含量均呈下降趨勢，不同基因型間存在極顯著差異；其根干重、根冠比、總根長、根系總表面積和平均直徑升高，表明低氮脅迫在一定程度上促進了光皮樺地下部生長。各指標在不同基因型光皮樺間存在顯著或極顯著差異，但僅G50-1各項指標變化均達到顯著或極顯著水平，表明G50-1能更好地響應(yīng)低氮脅迫，進而改變根系形態(tài)以攝取更多氮素，表現(xiàn)出更強的耐低氮能力。

表3 低氮脅迫對3種基因型光皮樺根系的影響Table 3 Effects of LN stress on roots in three genotypes of B. luminifera

2.4 低氮脅迫下光皮樺幼苗保護酶活性的變化

低氮脅迫對不同基因型光皮樺保護酶系統(tǒng)的影響不同(圖3)，且不同基因型光皮樺間存在極顯著差異。LN處理后3種基因型光皮樺POD和SOD活性均降低，其中優(yōu)3的POD和SOD活性顯著降低，G49-3的POD和SOD活性極顯著降低。保護酶活性的變化差異說明不同基因型光皮樺響應(yīng)長時間低氮脅迫時的抵御能力不同，G50-1降幅最低，表明其對低氮脅迫的抵御能力最強。

圖3 低氮脅迫下3種基因型光皮樺的POD和SOD活性變化Fig.3 The changes of POD and SOD activity in three genotypes of B. luminifera under LN stress

2.5 低氮脅迫下光皮樺幼苗NR活性的變化

NR是植物氮同化過程中的第一個酶，也是硝酸鹽同化過程中的限速酶，其活性強弱與植物體內(nèi)氮同化能力密切相關(guān)，NR活性越強，氮素代謝越旺盛[22]。與CK相比，LN處理下3個光皮樺基因型的NR活性均極顯著降低(圖4)，基因型對光皮樺NR活性的影響存在極顯著差異，其中G49-3降幅最大。正常供氮時，G50-1的NR活性不是最高，但在LN條件下降幅最小，活性最高，表明其具有較強的耐低氮能力。

圖4 低氮脅迫對3種基因型光皮樺NR活性的影響Fig.4 Effects of LN stress on NR activity in three genotypes of B. luminifera

2.6 低氮脅迫下光皮樺硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達分析

低氮處理后葉片中硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因NRT1.1和NRT1.2均下調(diào)表達(圖5-A)，但NRT2.1在G49-3中的相對表達量極顯著增加。根中表達模式與葉片中不同，NRT1.2在3個基因型光皮樺中均顯著下調(diào)表達，而NRT2.1極顯著上調(diào)表達(圖5-B)，這與NRT轉(zhuǎn)運蛋白主要通過根系吸收轉(zhuǎn)運硝酸鹽有密切關(guān)系。本試驗中，3個基因型光皮樺間NRT2.1表達水平變化存在極顯著差異，其中G49-3增幅最大，而優(yōu)3增幅最小。

2.7 3種基因型光皮樺耐低氮能力的綜合評價

光皮樺耐低氮能力受多種因素的綜合影響，上述用單一指標來評價3種光皮樺基因型的耐低氮能力存在不一致性。為提高對光皮樺耐低氮能力評價的準確性，運用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對3個基因型光皮樺的葉綠素、根冠比、總干重、氮積累量、SOD活性、NR活性等17個指標進行綜合評價(表5)?；陔`屬函數(shù)平均值，3個基因型的耐低氮能力強弱依次為G50-1>優(yōu)3>G49-3。

表4 光皮樺耐低氮能力的綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of LN tolerance in B. luminifera

注：A：低氮脅迫下光皮樺葉中NRTs的表達分析；B：低氮脅迫下光皮樺根中NRTs的表達分析。Note: A: Expression analysis of NRTs in B. luminifera leaves under LN stress. B: Expression analysis of NRTs in B. luminifera roots under LN stress.圖5 低氮脅迫對3種基因型光皮樺NRTs的表達分析Fig.5 The expression analysis of NRTs in three genotypes of B. luminifera under LN stress

3 討論

3.1 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的生長響應(yīng)特征

氮是植物生長發(fā)育最重要的營養(yǎng)成分，為植物細胞重要的構(gòu)成元素。缺氮情況下，植物快速響應(yīng)低氮脅迫，形態(tài)和生物量均受影響，但受影響程度存在顯著基因型差異[23]。本研究對3種基因型光皮樺在低氮脅迫下生長和生理生化指標進行分析，并結(jié)合隸屬函數(shù)綜合評價，結(jié)果顯示，G50-1 平均隸屬函數(shù)值(0.73)高于優(yōu)3(0.44)和G49-3(0.34)，表明光皮樺G50-1基因型為耐低氮型品種，而G49-3基因型為低氮敏感型品種。

本試驗中，低氮脅迫下光皮樺表型變化明顯，植株矮小，葉色發(fā)黃。氮素是葉綠素分子的重要組成成分，環(huán)境中氮素減少影響葉綠素合成從而使光合作用受阻[24]。3種基因型光皮樺中G49-3的葉綠素含量降幅最大，G50-1降幅最小，即耐低氮基因型光皮樺在低氮環(huán)境中仍能保持較高葉綠素含量，表現(xiàn)出較強的耐低氮能力。張楚等[10]研究表明，在低氮條件下苦蕎(Fagopyrumtataricum)的株高、葉面積、地上部干重和地上氮含量均顯著低于正常組，且耐低氮基因型降幅均小于不耐低氮基因型。本研究中，低氮脅迫影響光皮樺幼苗生長，地上部生長受限而促進根系生長；耐低氮基因型G50-1受低氮脅迫影響較小，其地上部性狀指標與不耐低氮基因型相比表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，對低氮環(huán)境適應(yīng)性更強。

研究表明，低氮脅迫下植物根吸收的氮雖然先運輸?shù)降厣喜浚歉嗤獣环峙涞礁繌亩垢诒仍黾覽1]。本試驗中，低氮脅迫下G50-1光皮樺的根冠比增幅最大，這與李強等[24]的“耐低氮基因型玉米根冠比增幅低于氮敏感基因型”研究結(jié)果不一致，可能因為光皮樺為多年生林木，根系較一年生農(nóng)作物更發(fā)達，且低氮脅迫同時影響光皮樺地上部和地下部生長。低氮處理后，3種基因型光皮樺的總根長、根系總表面積和平均直徑均增加，其中耐低氮基因型G50-1增幅最大。研究表明，當(dāng)土壤中NO3-有限時，根系形態(tài)特征對氮吸收尤為重要[25]，這與武永軍等[26]在氮虧缺條件下，植物為了盡可能尋找氮源而產(chǎn)生的補償效應(yīng)一致，這是植物在低氮條件下采取的最直接應(yīng)對方式之一。

3.2 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的生理響應(yīng)特征

植物處于逆境時，細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除間平衡被破壞，植物啟動相應(yīng)防御系統(tǒng)[27]。POD和SOD是植物細胞內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶，POD和SOD活性高低可以衡量植物在逆境條件下適應(yīng)能力的強弱[28]。本研究中，在低氮處理21 d后，3個基因型光皮樺幼苗保護酶活性均降低，其中G50-1下降最少，表明在低氮脅迫下耐低氮基因型能保持較高POD和SOD活性抵抗膜脂過氧化傷害，延緩葉片衰老[29]，從而更好地適應(yīng)低氮環(huán)境，這也是耐低氮基因型光皮樺耐低氮脅迫的重要生理機制之一。本試驗中保護酶活性變化趨勢與李小冬等[30]研究的結(jié)果不一致，但與張定一[1]的研究結(jié)果相符，可能與植物受脅迫時間長短有關(guān)，短時間內(nèi)低氮脅迫能誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)，減輕逆境帶來的氧化傷害，但隨著處理時間的延長，低氮脅迫對植物造成不可逆?zhèn)?，從而?dǎo)致POD和SOD活性降低。

大多數(shù)植物從土壤中吸收的氮素是硝酸鹽(NO3-)，硝酸鹽在參與合成體內(nèi)含氮有機化合物之前，必須先還原為氨。NR是氮代謝過程中的關(guān)鍵酶[31]，能在一定程度上反映植株的營養(yǎng)狀況以及硝酸鹽同化水平。本試驗中，低氮處理后3個基因型光皮樺NR活性均不同程度降低，且耐低氮基因型降幅小于氮敏感基因型。

3.3 低氮脅迫下不同基因型光皮樺的分子響應(yīng)特征

4 結(jié)論

低氮脅迫下光皮樺幼苗生長受到抑制，光皮樺株高、地上部干重、地上氮含量和氮積累量顯著降低，但低氮脅迫在一定程度上促進根系生長，表現(xiàn)為根冠比、根系總根長、總表面積和平均直徑升高；低氮脅迫使光皮樺幼苗葉綠素含量，POD、SOD和NR活性下降，但高親和力吸收系統(tǒng)中NRT2.1表達量增加以更好地調(diào)節(jié)氮代謝適應(yīng)低氮環(huán)境。不同基因型光皮樺對低氮脅迫的響應(yīng)存在顯著差異，耐低氮基因型在低氮環(huán)境中能保持較好生長優(yōu)勢，耐低氮能力更強。本研究結(jié)果為耐低氮脅迫種質(zhì)的篩選和培育提供了科學(xué)依據(jù)，同時表明運用常規(guī)遺傳改良手段篩選和培育耐低氮、氮高效的光皮樺良種是可行的。