甜瓜VQ家族基因鑒定及白粉病菌響應(yīng)分析

孫建磊 董玉梅 王崇啟 肖守華 高 超 焦自高

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站(山東)，山東 濟(jì)南 250100)

VQ家族基因是一類(lèi)植物所特有的基因，其編碼蛋白包含一種由10個(gè)氨基酸殘基組成的VQ保守結(jié)構(gòu)域(FxxhVQxhTG，x代表任意氨基酸殘基，h代表疏水性氨基酸殘基)。VQ蛋白主要通過(guò)2個(gè)高度保守的氨基酸殘基——纈氨酸(V)和谷氨酰胺(Q)與WRKY家族蛋白相互作用，從而調(diào)控下游一系列生理生化過(guò)程[1]。2005年，Andreasson等[2]采用酵母雙雜交方法從擬南芥中鑒定到第一個(gè)VQ基因，并證明其在抵御病原菌侵害中具有重要功能。此后，越來(lái)越多的VQ家族基因在不同植物體中被挖掘。目前，在擬南芥中已鑒定到29個(gè)VQ家族基因，水稻中包含40個(gè)、玉米中包含61個(gè)、大豆中包含74個(gè)、葡萄中包含18個(gè)，白菜中包含57個(gè)[3-8]。

功能研究表明，VQ蛋白不僅參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還參與植物體對(duì)各種生物脅迫以及非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中VQ14/IKU1在種子胚乳中高水平表達(dá)，該基因作為轉(zhuǎn)錄因子WRKY10的輔助因子，共同調(diào)控胚乳和種子發(fā)育[9]。AtVQ29編碼蛋白主要與光敏色素結(jié)合因子(phytochrome interacting factor，PIF)相互作用共同調(diào)控下游基因的表達(dá)，在幼苗光形態(tài)建成過(guò)程中具有重要功能[10]。此外，AtVQ20作為AtWRKY2和AtWRKY34的互作因子，協(xié)同調(diào)控花粉的發(fā)育、萌發(fā)以及花粉管的伸長(zhǎng)[11]。此外，VQ蛋白還參與植物體對(duì)各種生物脅迫以及非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。擬南芥VQ9蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子WRKY8的負(fù)調(diào)控因子，使其表達(dá)維持在適當(dāng)水平，從而增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的抗性[12]。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明VQ蛋白在植物抵御病原菌侵染過(guò)程中也具有重要功能。如灰霉病病菌可以誘導(dǎo)AtVQ16和AtVQ23上調(diào)表達(dá)，分別過(guò)量表達(dá)這2個(gè)基因均能增強(qiáng)植株對(duì)灰霉病的抗性[13]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明水稻在受到稻瘟病菌侵染之后，OsVQ22表達(dá)水平明顯升高，表明該基因參與了水稻對(duì)稻瘟病的抗性[14]。

越來(lái)越多的VQ家族基因在不同植物中被挖掘，進(jìn)一步的研究也證明這些基因編碼的蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮著各種各樣的功能。然而，甜瓜(CucumismeloL.)中VQ家族基因的鑒定及相關(guān)功能研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。甜瓜基因組序列測(cè)序的完成，使得從全基因組層面對(duì)甜瓜基因家族進(jìn)行系統(tǒng)研究成為可能[15]。本研究采用生物信息學(xué)的方法對(duì)甜瓜VQ家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其編碼蛋白的基本信息、基因結(jié)構(gòu)、保守motif、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、組織器官表達(dá)特征和白粉病菌侵染下的響應(yīng)等進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究VQ家族成員在甜瓜正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及逆境脅迫條件下的分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜瓜VQ家族基因鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

從甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cucurbitgenomics.org/organism/3)下載所有預(yù)測(cè)蛋白序列文件，并從pfam數(shù)據(jù)庫(kù)下載VQ結(jié)構(gòu)域Hidden Markov Model (HMM)序列 (PF05678)。然后，采用HMMER3進(jìn)行本地BLAST，E-value設(shè)置為1×10-3。最后，采用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)甜瓜候選VQ蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證并用于后續(xù)分析。從擬南芥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(http://www.arabidopsis.org)獲得所有VQ蛋白序列，采用Clustal Omega在線軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)將29個(gè)擬南芥VQ蛋白序列和26個(gè)甜瓜VQ蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用MEGA7.0軟件，選用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)為Bootstrap=1 000[16]。

1.2 甜瓜VQ家族成員生物信息學(xué)分析

甜瓜VQ基因內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均來(lái)自于葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CGD(http://cucurbitgenomics.org/)。運(yùn)用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析甜瓜VQ家族成員的分子量和等電點(diǎn)；利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/tools/meme)鑒定蛋白保守基序，其參數(shù)設(shè)置基序數(shù)量12個(gè)，其余參數(shù)均為默認(rèn)[17]。

1.3 甜瓜種植、白粉病菌侵染及取樣

以栽培甜瓜M1為材料，播種于人工氣候室內(nèi)，光周期設(shè)置為16 h/8 h(光照/黑暗)，晝夜溫度設(shè)置為28°C/22°C。當(dāng)植株生長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，采用白粉病菌孢子懸浮液噴霧法人工接種白粉病菌促使植株發(fā)病，接種孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1，接菌后黑暗培養(yǎng)12 h，濕度保持在75%以上[18]。分別于接菌后0、24、48、72 h收集植株的葉片組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。樣品于液氮中速凍后保存于-80℃低溫冰箱中備用。

1.4 甜瓜VQ家族基因組織表達(dá)分析

甜瓜VQ家族基因在不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)(FPKM值)從甜瓜功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gene.melonet-db.jp/cgi-bin/melview.cgi)獲得。首先將基因表達(dá)數(shù)據(jù)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化為log2(FPKM value+1)，然后采用R軟件(http://www.r-project.org/)繪制甜瓜VQ基因在13個(gè)不同組織的表達(dá)熱圖。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用Trizol法提取樣品總RNA，并采用TaKaRa公司(大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒參考說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用Roche SYBR Green Master法。反應(yīng)體系包括5 μL SYBR Green Master MIX、上下游引物各1 μL、1 μL cDNA 和2 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)；設(shè)置3次重復(fù)。以甜瓜Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法[19]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primer sequences used for quantitative RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜VQ家族基因鑒定及編碼蛋白特征分析

為了對(duì)甜瓜VQ家族基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，以VQ蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列(PF05678)為參考，從甜瓜全基因組水平進(jìn)行VQ家族基因和蛋白的挖掘。由表2可知，試驗(yàn)總共鑒定到26個(gè)甜瓜VQ基因，這些基因不均等地分布在除09號(hào)染色體外的11條染色體上。結(jié)構(gòu)分析表明，甜瓜VQ基因均不包含內(nèi)含子，由單個(gè)外顯子組成。該家族基因編碼蛋白長(zhǎng)度在81～413氨基酸殘基之間；最小蛋白分子量為9.25 kDa，最大蛋白分子量為43.53 kDa；等電點(diǎn)在4.59～11.29之間。07和08號(hào)染色體上分別含有6個(gè)VQ基因。

表2 甜瓜VQ家族成員基本信息Table 2 The basic information of VQ family gene in melon

2.2 甜瓜VQ家族蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

蛋白序列比對(duì)分析結(jié)果表明，甜瓜VQ蛋白均含有保守的FxxhVQxhTG結(jié)構(gòu)域，其中21個(gè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镕xxhVQxLTG，其他5個(gè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镕xxhVQxFTG(圖1)。為了進(jìn)一步明確甜瓜VQ家族基因的進(jìn)化關(guān)系，將甜瓜VQ家族蛋白與擬南芥、水稻、玉米VQ家族蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2)。根據(jù)前人研究中擬南芥、水稻、玉米聚類(lèi)分析結(jié)果，甜瓜VQ家族蛋白可分為7個(gè)亞家族(Ⅰ～Ⅶ)。其中，亞家族Ⅲ含有6個(gè)甜瓜VQ蛋白，亞家族Ⅳ和Ⅴ均含有5個(gè)甜瓜VQ蛋白，亞家族Ⅱ含有4個(gè)甜瓜VQ蛋白，亞家族Ⅶ含有3個(gè)甜瓜VQ蛋白，亞家族Ⅵ含有2個(gè)甜瓜VQ蛋白，亞家族Ⅰ含有1個(gè)甜瓜VQ蛋白。同一個(gè)亞家族內(nèi)的基因(蛋白)往往具有較高的同源性和相近的進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)具有相似的分子功能。

圖1 甜瓜VQ家族蛋白VQ基序多重比對(duì)分析Fig.1 Multiple sequence alignment of the VQ motif in melon VQ proteins

2.3 甜瓜VQ家族蛋白保守motif分析

保守motif的數(shù)量和類(lèi)型決定了VQ蛋白具有不同的分子功能。為了進(jìn)一步揭示甜瓜VQ家族蛋白分子功能，對(duì)甜瓜VQ家族蛋白中的保守motif進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。由圖3可知，甜瓜VQ家族蛋白最少含有1個(gè)保守motif，最多含有6個(gè)保守motif。此外，motif 1、2、5、11在甜瓜VQ家族蛋白中分布比較廣泛，表明這些motif可能在甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要功能。

2.4 甜瓜VQ家族基因組織表達(dá)分析

基因家族不同成員功能發(fā)揮和其表達(dá)模式密切相關(guān)。目前，隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，甜瓜不同組織及不同發(fā)育時(shí)期所有基因的表達(dá)數(shù)據(jù)已在甜瓜功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)，為不同家族基因的組織表達(dá)特征分析提供了基礎(chǔ)。本研究初步分析了26個(gè)甜瓜VQ家族基因在13種不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。由圖4可知，除了MELO3C008397和MELO3C003285在不同組織均未被檢測(cè)到之外，其他24個(gè)基因均在甜瓜中表達(dá)且具有不同表達(dá)模式。其中，MELO3C013853在所有組織中均具有較高的表達(dá)水平，MELO3C023436和MELO3C016694在除種子以外的其他組織中均具有較高表達(dá)水平；而MELO3C017312和MELO3C010713僅在種子中特異表達(dá)，MELO3C009629、MELO3C004409、MELO3C016231僅在根中特異表達(dá)，MELO3C009575僅在花藥中特異表達(dá)，MELO3C016156僅在成年葉中具有較高表達(dá)水平；MELO3C011042在子房中表達(dá)水平明顯高于其他組織，MELO3C003409在根、莖、葉、花中表達(dá)水平較高，MELO3C003561在根、葉、須、雌花花瓣、果皮及種子中均高水平表達(dá)，MELO3C016947在成年葉和種子中具有較高表達(dá)水平，MELO3C017584在根、莖、幼葉、子房和果皮中表達(dá)水平明顯高于其他組織，MELO3C026380在花、果肉和種子中表達(dá)水平明顯高于其他組織，MELO3C007028在根、成年葉和雌花中表達(dá)水平明顯高于其他組織，MELO3C007278在根、莖、幼葉、卷須和子房中表達(dá)水平明顯高于其他組織。

2.5 甜瓜VQ家族基因白粉病菌響應(yīng)分析

VQ家族蛋白作為WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子參與多種生物及非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。為了揭示VQ家族基因在甜瓜抗白粉病中的功能，本研究對(duì)甜瓜葉片中VQ家族基因在白粉病菌侵染后的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。甜瓜幼苗在白粉病菌侵染后第7天出現(xiàn)白粉病表型，而清水處理植株無(wú)發(fā)病表型(圖5-A)。與對(duì)照(清水處理)相比，MELO3C016947和MELO3C016156在白粉病菌侵染24 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，MELO3C019076在白粉病菌侵染48 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，表明這3個(gè)VQ基因在甜瓜抵御白粉病菌侵染過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用；MELO3C016694、MELO3C023436、MELO3C023257和MELO3C013853在白粉病菌侵染24 h后出現(xiàn)顯著或極顯著下調(diào)表達(dá)，MELO3C007278在白粉病菌侵染48 h后出現(xiàn)極顯著下調(diào)表達(dá)，表明這些VQ家族基因在甜瓜抵御白粉病菌侵染過(guò)程中起正調(diào)控作用(圖6)。

圖2 甜瓜VQ家族蛋白與擬南芥、水稻、玉米VQ家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of VQ proteins in melon, Arabidopsis, rice and maize

圖3 甜瓜VQ家族蛋白保守motif分析Fig.3 Conserved motif of VQ family proteins in melon

圖4 甜瓜VQ家族基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.4 The expression patterns of VQ family genes in different tissues of melon

注：A: 清水處理植株表型；B: 白粉病菌處理植株表型。Note: A: The phenotype of melon seedlings treated with water. B: The phenotype of melon seedlings infected with powdery mildew.圖5 白粉病菌侵染后甜瓜幼苗發(fā)病表型Fig.5 The phenotype of melon seedlings after powdery mildew infection

注：*和**表示各處理間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。Note: * and ** mean the signifcant difference among different treatments at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖6 8個(gè)甜瓜VQ基因白粉病菌響應(yīng)分析Fig.6 Differential expression patterns of nine VQs response to powdery mildew infection

3 討論

甜瓜屬葫蘆科一年生二倍體植物，其果實(shí)香脆清甜、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物。然而，當(dāng)前的甜瓜主栽品種在生產(chǎn)中極易受到白粉病侵害，嚴(yán)重制約了甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的形成[20-23]。因此，挖掘甜瓜抗白粉病基因并揭示其抗病分子機(jī)制已成為甜瓜抗病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。為了研究甜瓜中VQ家族基因的具體功能，本研究采用生物信息學(xué)方法從甜瓜基因組水平鑒定到26個(gè)VQ基因。該數(shù)量與擬南芥中VQ基因數(shù)量基本一致，但明顯少于玉米(41)和大豆(74)中VQ基因數(shù)量，這可能與其基因組大小差異及基因組復(fù)制事件有關(guān)。玉米基因組大約為2 500 Mb，是擬南芥基因組大小的20倍、水稻基因組的6倍，大約編碼50 000個(gè)基因[8]。大豆基因組大約為1 100 Mb，其基因組在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)過(guò)了2次復(fù)制過(guò)程以及大量的基因復(fù)制事件，從而導(dǎo)致大豆基因組中75%以上基因?yàn)槎嗫截惢騕5]。甜瓜基因組大小為375 Mb，編碼27 000 個(gè)基因[15]。同時(shí)，甜瓜中大部分基因?yàn)閱慰截惢?，?dǎo)致甜瓜VQ基因數(shù)目明顯少于玉米和大豆中VQ基因數(shù)目。

本研究結(jié)果表明，26個(gè)甜瓜VQ基因均不包含內(nèi)含子，該結(jié)果與其他植物如擬南芥[3]、水稻[4]、大豆[5]、葡萄[6]等中基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本一致。擬南芥和水稻中VQ基因均不包含內(nèi)含子，同時(shí)玉米和葡萄中大部分VQ基因不包含內(nèi)含子序列，僅有6個(gè)玉米VQ基因包含1或2個(gè)內(nèi)含子，葡萄中僅有1個(gè)VQ基因含有1個(gè)內(nèi)含子。以上結(jié)果表明，VQ家族成員基因結(jié)構(gòu)在不同物種間具有高度保守性。

研究表明，擬南芥中VQ蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控輔助因子，可與多種WRKY蛋白互作共同參與調(diào)控植物的多種生理生化過(guò)程，如種子發(fā)育和萌發(fā)，滲透脅迫及鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程以及抗病反應(yīng)等[24-26]。不同物種之間具有相似或相同功能的基因往往在序列和結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中的距離越近[27-30]。同時(shí)，基因在不同組織器官以及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式與其功能的發(fā)揮有著密切聯(lián)系。因此，系統(tǒng)進(jìn)化分析和組織表達(dá)分析結(jié)果可為預(yù)測(cè)甜瓜VQ基因的功能提供一定的參考。在本研究中，序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，MELO3C003409與擬南芥VQ家族成員AT2G41180 (AtVQ16/AtSIB1)直系同源。該基因在擬南芥中編碼一個(gè)Sigma蛋白結(jié)合因子，并與AtWRKY33蛋白的C端相互作用，在抵御灰霉病過(guò)程中發(fā)揮重要功能。表達(dá)分析表明，MELO3C003409在甜瓜根、莖、葉、花中表達(dá)水平較高，推測(cè)其在甜瓜植株抵御病害過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。此外，甜瓜MELO3C023436與擬南芥AT1G78310 (AtVQ9)直系同源，研究證明，AtVQ9通過(guò)與WRKY8的互作抑制后者與W-box的結(jié)合活性，從而負(fù)調(diào)控植物抗鹽性[12]。本研究中，MELO3C023436在除種子以外的甜瓜其他組織中均具有較高表達(dá)水平，推測(cè)其在甜瓜響應(yīng)高鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮相似的功能。

Wang等[6]研究表明葡萄植株在白粉病菌侵染之后，5個(gè)VQ家族基因上調(diào)表達(dá)，3個(gè)VQ家族基因表達(dá)明顯下調(diào)，該結(jié)果第一次表明VQ家族成員響應(yīng)白粉病菌侵害過(guò)程，為進(jìn)一步研究其具體功能和抗病機(jī)理提供了基礎(chǔ)。為了研究VQ家族基因在甜瓜抵御白粉病過(guò)程的功能，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了甜瓜VQ家族成員在白粉病菌侵染條件下的表達(dá)模式變化，結(jié)果表明3個(gè)甜瓜VQ基因上調(diào)表達(dá)，5個(gè)VQ基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明這8個(gè)甜瓜VQ基因在抵御白粉病菌侵染過(guò)程中可能發(fā)揮重要的功能。因此，根據(jù)本研究的結(jié)果應(yīng)集中于甜瓜抗白粉病相關(guān)VQ家族基因進(jìn)行進(jìn)一步功能驗(yàn)證和利用，從而為甜瓜抗白粉病新品種改良提供理論支撐。

4 結(jié)論

本研究首次從甜瓜基因組中鑒定到26個(gè)VQ家族成員，命名為CmVQ，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體分布和表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，甜瓜VQ家族成員基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守，且不均勻地分布在甜瓜11條染色體上。該家族成員編碼蛋白可分為7個(gè)亞家族，表明甜瓜VQ不同成員間具有不同生物功能。組織表達(dá)譜分析表明23個(gè)甜瓜VQ家族基因組織特異性表達(dá)，僅1個(gè)甜瓜VQ家族基因組成性表達(dá)。此外，白粉病菌侵染之后，6個(gè)甜瓜VQ家族基因呈現(xiàn)不同程度的響應(yīng)，推測(cè)其在甜瓜抵御白粉病侵染過(guò)程中發(fā)揮重要功能。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究甜瓜VQ家族基因在抗白粉病中的功能奠定了基礎(chǔ)。