玉米抗玉米蚜種質(zhì)的鑒定與抗性位點(diǎn)的定位分析

宋 煒 李興華 王江浩 張動(dòng)敏 張全國(guó) 王立偉 魏劍鋒 李榮改

(河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室, 河北 石家莊 050035)

玉米(ZeamaysL.，2n=20)是世界上主要的糧食作物之一。我國(guó)是世界第二大玉米生產(chǎn)大國(guó)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20%，因此玉米生產(chǎn)在保障我國(guó)糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用[1]；而且隨著全球氣候變暖，玉米作為一種適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的糧食作物越來(lái)越受到重視[2]。玉米蚜(RhopalosiphummaidisFitch)對(duì)玉米生產(chǎn)的危害是一個(gè)全球性問(wèn)題[3]。玉米蚜直接從植株體內(nèi)吸食汁液對(duì)玉米造成危害，并且還作為病毒的載體傳播，如玉米矮花葉病毒等多種病毒，引起病害，嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)[4]。近年來(lái)，隨著我國(guó)玉米生產(chǎn)由單一的籽粒生產(chǎn)向鮮食、糧飼兼用或青貯專用生產(chǎn)的方向發(fā)展，受種植密度增加及夏季天氣干旱少雨等因素的影響，玉米蚜的發(fā)生更趨嚴(yán)重，嚴(yán)重年份可造成玉米減產(chǎn)50%[2]。而且玉米蚜有著極高的繁殖率，單頭蚜蟲可在6個(gè)星期內(nèi)生產(chǎn)5.9萬(wàn)個(gè)后代[5]，并能產(chǎn)生有翅遷移蚜，給化學(xué)防治帶來(lái)困難。因此，選育抗蚜蟲品種是防治蟲害和保護(hù)生態(tài)環(huán)境最有效的方法；篩選抗蚜玉米新種質(zhì)、對(duì)其抗蚜性進(jìn)行遺傳分析、定位和克隆抗性基因，對(duì)開展玉米抗蚜育種具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

國(guó)外從上世紀(jì)20年代就已經(jīng)開始了玉米對(duì)蚜蟲的抗性研究，Gernert[6]在1917年首次報(bào)道了利用一年生蜀黍(Euchlaenamexicana)與黃色馬齒型玉米雜交，其雜種F1從玉米的野生近緣種中獲得了對(duì)玉米蚜的抗性。我國(guó)開展玉米抗蚜研究起步晚，多集中于生產(chǎn)上不同玉米品種(系)的抗蚜鑒定，很少涉及對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)性的抗性鑒定和遺傳研究[7-8]。國(guó)內(nèi)外研究顯示，雖然鑒定出少數(shù)抗性種質(zhì)資源，但在玉米中未發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米蚜免疫的材料，且對(duì)少數(shù)抗性資源進(jìn)行了遺傳研究[9-13]。對(duì)來(lái)自熱帶甜玉米自交系A(chǔ)A8sh2的抗蚜性遺傳研究發(fā)現(xiàn)，其抗性是隱性的，連鎖分析發(fā)現(xiàn)了2個(gè)抗性位點(diǎn)aph和aph2，分別被定位在第10和第2染色體[10, 14-16]。而對(duì)溫帶玉米抗蚜性遺傳研究發(fā)現(xiàn)抗性受多個(gè)基因控制，加性效應(yīng)大于非加性效應(yīng)[11, 17-19]。近年來(lái)，隨著玉米基因組序列的獲得和全基因組關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，分別在玉米第1、第4、第5、第6、第7和第10染色體上發(fā)現(xiàn)了對(duì)玉米蚜的抗性位點(diǎn)，能夠解釋15%～27%的抗性表型變異[4, 11, 20]。以上研究結(jié)果表明，玉米對(duì)玉米蚜的抗性遺傳機(jī)制比較復(fù)雜，抗性遺傳一般受多基因與環(huán)境共同控制。為了挖掘玉米抗蚜基因和改良品種的抗性，本研究在篩選玉米抗蚜種質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)玉米抗蚜性狀進(jìn)行遺傳分析，并采用分離群體分組分析法(bulk segregation analysis，BSA)與特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序(specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)相結(jié)合的方法對(duì)抗性位點(diǎn)進(jìn)行定位分析，以期為抗蚜基因的克隆和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在河北省石家莊市藁城區(qū)河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗(yàn)站進(jìn)行。國(guó)內(nèi)外收集的98份玉米種質(zhì)資源(表1)分別于2014年和2015年的5月20日、6月15日分兩期播種，進(jìn)行兩年共4個(gè)處理(環(huán)境)的田間抗蚜性鑒定。每份材料單行區(qū)種植，行長(zhǎng)5 m，行距0.6 m，每穴雙粒點(diǎn)播，每行播種18穴，出苗后每穴定苗留1株。生長(zhǎng)期間肥水管理同一般大田。

1.2 試驗(yàn)材料的抗蚜鑒定

每小區(qū)定點(diǎn)5株，分別在玉米生長(zhǎng)發(fā)育的苗期、小喇叭口期、大喇叭口期、抽雄期，田間調(diào)查蚜蟲數(shù)量2次，2次間隔3 d，從授粉期至收獲，每間隔5 d調(diào)查1次；抽雄期以前每株調(diào)查心葉、展開葉葉片和葉鞘上的玉米蚜數(shù)量，抽雄期后調(diào)查葉片、葉鞘、雄穗、雌穗上的玉米蚜數(shù)量。計(jì)數(shù)精度視蟲口密度而定，當(dāng)每株蟲量在50頭以下逐頭實(shí)數(shù)，50頭以上時(shí)，分別以10頭或20頭為單位目測(cè)估計(jì)。參考董懷玉等[21]抗蚜性等級(jí)確定方法和蚜情指數(shù)進(jìn)行抗蚜性鑒定和評(píng)價(jià)。

蚜情指數(shù)=某份玉米材料的平均蚜量/全部觀測(cè)玉米材料的平均蚜量。即根據(jù)每份玉米材料上的蚜情指數(shù)，將其抗蚜性劃分為免疫(immune，IMMU)、高抗(high resistance，HR)、抗(resistance，R)、感(sense，S)、中感(medium sense，MS)、高感(high sense，HS)6級(jí)，其蚜情指數(shù)分別為0、0～0.25、0.26～0.50、0.51～0.75、0.76～1.25和大于1.25。

1.3 F2群體的抗蚜鑒定

2015年夏天，以高抗蚜蟲玉米自交系32t33為父本，高感蚜蟲玉米自交系335HX為母本配制雜交組合，秋天收獲的F1種子在2015年冬季種植于海南省三亞市河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所試驗(yàn)站，自交獲得F2種子。2016年6月15日將收獲的762粒F2遺傳分離群體與雙親及F1一起， 采取單粒播種的方法種植于堤上試驗(yàn)站玉米試驗(yàn)田進(jìn)行抗蚜性鑒定。

在田間F2群體種植圃， 對(duì)762個(gè)單株授粉后，采用田間蚜蟲自然繁殖和人工接蟲相結(jié)合的方法進(jìn)行抗蚜性鑒定。在授粉后第10天開始根據(jù)上述蚜蟲調(diào)查方法進(jìn)行第一次調(diào)查后，在每株果穗以下第一片葉的葉腋處接蟲約10～20頭，接蟲后7 d進(jìn)行第二次蚜蟲數(shù)量調(diào)查，繼而進(jìn)行第2次接蟲，再過(guò)7 d進(jìn)行第三次蚜蟲數(shù)量調(diào)查，收獲前進(jìn)行最后一次調(diào)查。根據(jù)4次的結(jié)果計(jì)算F2群體各單株的蚜情指數(shù)。

1.4 DNA提取和混池的構(gòu)建

在苗期采集335HX×32t33雜交組合的雙親、F1和F2群體單株的新鮮嫩葉，采用改良的 CTAB法提取DNA[22]，用1%瓊脂糖凝膠，電壓120 V，電泳50 min檢測(cè)DNA質(zhì)量，并利用NannoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定DNA濃度。DNA樣品的OD260/280值在 1.8～2.0之間，濃度≥50 ng·μL-1， 總量≥2 μg，無(wú)降解的DNA用于混池的構(gòu)建。

根據(jù)F2群體762個(gè)單株抗蚜鑒定結(jié)果，分別選取高抗蚜、高感蚜單株各40株的DNA等量混合，分別構(gòu)建最終濃度為30 ng·μL-1的抗、感混池，與雙親的DNA樣品一起用于特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序(SLAF-seq)。

1.5 SLAF文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

以玉米基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-24/fasta/zea_mays/)為參考基因組進(jìn)行電子酶切預(yù)測(cè)后，選用HaeⅢ和Hpy166III雙酶對(duì)雙親以及2個(gè)混池的基因組DNA樣品進(jìn)行酶切，酶切片段長(zhǎng)度在414～464 bp的序列定義為SLAF 標(biāo)簽，回收得到的酶切片段進(jìn)行3′端加A處理、連接Dual-index測(cè)序接頭[23]、PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，利用IlluminaHiSeqTM2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.6 SLAF標(biāo)簽的開發(fā)和SNP檢測(cè)

對(duì)SLAF-seq測(cè)序獲得的序列進(jìn)行比對(duì)并根據(jù)序列相似度進(jìn)行聚類，獲得在不同樣品間序列有差異的多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽(這種序列多態(tài)性主要包括SNP 和Indel標(biāo)記)，利用BWA軟件[24]將SLAF 標(biāo)簽與玉米參考基因組比對(duì)，確定在基因組的位置。使用GATK 軟件工具包的局部重比對(duì)(local realignment)對(duì)SLAF標(biāo)簽中的SNP進(jìn)行變異檢測(cè)，從而獲得多態(tài)性SNP標(biāo)記。

1.7 BSA關(guān)聯(lián)分析

采用ED(euclidean distance)算法[25]計(jì)算與目的基因連鎖的區(qū)域。利用兩混池間差異SNP的頻率的差異，計(jì)算兩混池間SNP的ED值，ED值越大表明該SNP在兩混池間的差異越大。根據(jù)連鎖的原理，真實(shí)的關(guān)聯(lián)區(qū)域附近的SNP位點(diǎn)會(huì)傾向于在兩混池間表現(xiàn)出差異，因此目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的ED值越大。根據(jù)ED值作圖，在目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的附近會(huì)出現(xiàn)較明顯的峰。為消除背景噪音，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)原始ED值進(jìn)行2次方處理，然后對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行SNPNUM擬合，取所有位點(diǎn)擬合值的中位數(shù)與3倍的標(biāo)準(zhǔn)差之和(median+3SD)作為分析的關(guān)聯(lián)閾值，根據(jù)關(guān)聯(lián)閾值確定最終關(guān)聯(lián)區(qū)域。公式如下：

表1 參試玉米種質(zhì)資源來(lái)源及抗蚜性表現(xiàn)Table 1 The origin of maize germplasm resources and their aphid-resistance evaluation

表1(續(xù))

式中，Amut表示在SNP位點(diǎn)上A堿基在隱性(抗蚜)混池中的深度；Awt表示A堿基在顯性(感蚜)混池中的深度。依次類推。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米不同發(fā)育時(shí)期玉米蚜種群的數(shù)量動(dòng)態(tài)

由圖1可知，玉米蚜種群數(shù)量在抽雄期前極少，之后隨著大量有翅蚜的遷入并大量繁殖，使得成熟期單株蚜蟲量平均達(dá)到1 200頭以上，表明玉米蚜的發(fā)生盛期出現(xiàn)在玉米抽雄期至成熟期。因此，應(yīng)在玉米抽雄后對(duì)其進(jìn)行抗蚜性鑒定和篩選。

圖1 蚜蟲種群在玉米不同發(fā)育時(shí)期的數(shù)量動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamics of aphid population at different maize developmental stages

2.2 不同玉米種質(zhì)對(duì)玉米蚜抗性水平的影響

根據(jù)蚜情指數(shù)對(duì)98份參試玉米種質(zhì)資源進(jìn)行抗蚜性鑒定和評(píng)價(jià)。比較每份參試玉米種質(zhì)資源在2個(gè)不同播期玉米蚜的種群數(shù)量發(fā)現(xiàn)，5月中旬播種(春播)的所有玉米種質(zhì)資源材料在整個(gè)發(fā)育時(shí)期玉米蚜數(shù)量均明顯低于6月播種(夏播)的玉米蚜數(shù)量(數(shù)據(jù)未列出)。每份材料單株的玉米蚜蟲數(shù)量和蚜情指數(shù)分析結(jié)果顯示，沒(méi)有對(duì)玉米蚜表現(xiàn)免疫的種質(zhì)資源； 5份表現(xiàn)為高抗，分別是IRF312、B123、B112、32t33和DM3/335F；包括335HX在內(nèi)的17份表現(xiàn)高感(表1、表2)。從參試種質(zhì)資源的總體表現(xiàn)看，88.78%的玉米種質(zhì)資源表現(xiàn)感玉米蚜，表明現(xiàn)有的玉米種質(zhì)資源中缺乏玉米蚜的抗源，尤其缺少對(duì)蚜蟲侵染表現(xiàn)免疫的材料。

表2 98份玉米種質(zhì)資源的抗蚜性鑒定結(jié)果Table 2 Aphid-resistance evaluation of ninety-eight maize germplasm resources

2.3 32t33自交系的抗蚜性遺傳

為了明確篩選出的高抗玉米蚜32t33自交系的抗蚜遺傳特性，利用其與高感蚜自交系335HX配制雜交組合，對(duì)組合的雙親及其雜交后代F1、F2群體單株的蚜蟲群口數(shù)量和抗蚜等級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2、圖3)。結(jié)果顯示，雜交種F1和感蚜親本的蚜情指數(shù)分別為0.908、0.904，在感蚜表現(xiàn)上一致，F(xiàn)2群體表現(xiàn)抗、感蚜分離且呈正態(tài)分布，表明32t33自交系的抗蚜性遺傳為隱性且表現(xiàn)數(shù)量性狀特征。

圖2 供試材料的蚜情指數(shù)Fig.2 Aphid index of plant materials

圖3 F2群體抗蚜等級(jí)頻數(shù)分布圖Fig.3 Frequency distribution of aphid resistance in the F2 population

2.4 SLAF標(biāo)簽開發(fā)及其在玉米染色體上的分布

對(duì)利用玉米32t33與335HX雜交后代F2群體單株構(gòu)建的抗、感蚜2個(gè)混池的DNA和雙親的DNA樣品，經(jīng)HaeⅢ+Hpy166III雙酶切所產(chǎn)生的414～464 bp片段進(jìn)行測(cè)序。利用BWA軟件將測(cè)序結(jié)果與玉米參考基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品的序列與參考基因組序列重疊率在98.84%以上，表明測(cè)序結(jié)果能真實(shí)反映雙親及2個(gè)混池基因組信息，共獲得364 147個(gè)SLAF標(biāo)簽，抗蚜混池平均測(cè)序深度為70.45×，感蚜混池平均測(cè)序深度為65.68×，兩混池平均測(cè)序深度為68.07×，總測(cè)序深度為136.13×(表3)。由表4可知，有357 778個(gè)SLAF標(biāo)簽定位到玉米染色體上，開發(fā)的標(biāo)記有效率為98.25%。在每條染色體上的標(biāo)記數(shù)量在23 870～52 668之間，開發(fā)的SLAF標(biāo)簽在不同染色體上均勻分布，覆蓋了整個(gè)基因組(圖4)，可以用于進(jìn)一步分子標(biāo)記的開發(fā)。

表3 抗、感蚜混池開發(fā)的SLAF標(biāo)記統(tǒng)計(jì)表Table 3 The statistics of developed SLAF markers for resistant and susceptible bulks

2.5 多態(tài)性SNP標(biāo)記分析

根據(jù)定位到染色體上的多態(tài)性SLAF標(biāo)簽序列信息，利用GATK軟件的序列局部重比對(duì)功能對(duì)SLAF標(biāo)簽中存在的序列變異的SNP進(jìn)行檢測(cè)，一共檢測(cè)到11 052 576個(gè)SNP標(biāo)記(表5)。濾掉可信度低的標(biāo)記后，最終得到高質(zhì)量的可信SNP 位點(diǎn)46 553 個(gè)。這些SNP在父本32t33、母本335HX、抗蚜混池、感蚜混池樣本中的雜合度分別為28.81%、24.42%、81.62%和75.61%，兩混池的雜合度高于雙親，雜合度的分布符合親本及混池的特征，表明開發(fā)的SNP標(biāo)記可用于進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析。

表4 SLAF標(biāo)記在每條染色體分布統(tǒng)計(jì)表Table 4 The distribution of SLAF markers on each chromosome

注：橫坐標(biāo)為染色體物理長(zhǎng)度(Mb)，每一個(gè)黃色條帶代表一條染色體，色條代表SLAF密度；顏色的深淺表示SLAF 標(biāo)記在這些區(qū)域的數(shù)量。Note: The x-axis indicates the physical position in megabases(Mb). Each yellow band represents a chromosome. The color bar shows the SLAF density. Dark and light colors denote the SLAF marker numbers at these loci.圖4 SLAF標(biāo)記在每條玉米染色體上的分布Fig.4 The distribution of SLAF markers on each maize chromosome

2.6 抗蚜性候選區(qū)域的篩選

利用獲得的46 553 個(gè)可信多態(tài)性SNP位點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的ED值，并對(duì)ED值進(jìn)行擬合得到關(guān)聯(lián)值分布(圖5)。以所有位點(diǎn)擬合值的中位數(shù)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和(0.12)為閾值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將抗蚜性關(guān)聯(lián)到2個(gè)區(qū)段，分別位于第3、第5染色體上(圖5)。位于第3染色體的區(qū)域在70 453 782～108 289 839 bp之間的19.66 Mb范圍內(nèi)，第5染色體的區(qū)域在177 885 175～184 229 926 bp之間6.34 Mb范圍內(nèi)(表6)。

表5 樣品中檢測(cè)到的SNP統(tǒng)計(jì)表Table 5 The statistics of detected SNPs in the used samples

圖5 混池ED關(guān)聯(lián)分析結(jié)果圖Fig.5 The results from bulk ED association analysis

2.7 抗蚜候選基因的篩選

針對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的基因，分析其外顯子區(qū)域在2個(gè)親本之間差異的SNP信息，對(duì)SNP進(jìn)行變異的注釋，共發(fā)現(xiàn)存在非同義突變的SNP有85個(gè)，對(duì)應(yīng)到43個(gè)基因上，這些基因可能是與抗蚜性狀直接相關(guān)的功能基因。將存在非同義突變的基因分別與NR、Swiss-Prot、GO、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行深度注釋，并結(jié)合與模式植物擬南芥中同源基因的功能注釋，進(jìn)一步篩選與植物免疫、抗性有關(guān)的基因，縮小候選基因的范圍。根據(jù)抗性基因編碼的抗性蛋白具有的保守區(qū)域序列，在關(guān)聯(lián)區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)具有抗性蛋白結(jié)構(gòu)域的基因，分別是Zm00001d041215、Zm00001d041298、Zm00001d016953(表7)。前2個(gè)基因位于第3染色體，編碼具有LRR-RLK(leucine rich repeat receptor-like kinases)功能域的激酶，后1個(gè)基因位于第5染色體關(guān)聯(lián)區(qū)域，編碼典型的受體蛋白，其含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1，certain R gene products and CED-4)。除3個(gè)抗性基因外，還發(fā)現(xiàn)2個(gè)位于第3染色體關(guān)聯(lián)區(qū)域的基因Zm00001d041220和Zm00001d040936，其同源基因在擬南芥中具有防御病害、逆境的功能[26-27]。在關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的5個(gè)與免疫、抗性相關(guān)的基因可作為抗蚜候選基因做進(jìn)一步研究。

3 討論

研究玉米蚜在玉米整個(gè)生育期的發(fā)生規(guī)律是蚜蟲綜合防治的基礎(chǔ)，對(duì)玉米生產(chǎn)上選擇適宜的防治時(shí)期具有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果表明，玉米蚜在不同玉米品種上發(fā)生高峰表現(xiàn)比較一致，均在玉米抽雄后的灌漿期，也是蚜蟲對(duì)玉米危害最嚴(yán)重的時(shí)期(圖1)。這與以往一些研究結(jié)果一致，玉米蚜繁殖高峰期也正是玉米產(chǎn)生和積累營(yíng)養(yǎng)的最佳時(shí)期[8-9, 28]。玉米蚜的繁殖同時(shí)還受環(huán)境因素的影響，如光照、溫度、濕度等，既可以直接影響玉米的抗性，又可以通過(guò)影響蚜蟲繁殖間接影響玉米的抗性[7]。因此，在田間應(yīng)選擇在灌漿期對(duì)玉米品種進(jìn)行抗蚜鑒定和評(píng)價(jià)，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表6 關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)表Table 6 The statistic of associated regions

玉米為異花授粉作物，遺傳多樣性豐富，對(duì)蚜蟲的抗性也表現(xiàn)出很大的差異[29-30]。本研究在2年2個(gè)播期共4個(gè)不同環(huán)境下對(duì)近百份玉米種質(zhì)資源的抗蚜性狀進(jìn)行鑒定，未發(fā)現(xiàn)對(duì)蚜蟲免疫的材料，僅篩選出包括32t33在內(nèi)的5份高抗蚜材料(表2)。這與其他國(guó)內(nèi)外研究者認(rèn)為已應(yīng)用的玉米種質(zhì)資源缺乏抗玉米蚜的玉米種質(zhì)，抗蚜遺傳基礎(chǔ)狹窄的觀點(diǎn)一致[8-9]。少數(shù)表現(xiàn)高抗蚜的玉米種質(zhì)資源，如Minnesota 13、Oh43、Oh45、L317、Mo17、A632、Ky21、Mo18w等，也是非常重要的遺傳育種基礎(chǔ)材料[9, 12]。本研究鑒定篩選出的抗蚜性種質(zhì)材料豐富了抗蚜遺傳育種資源，特別是玉米自交系32t33不僅對(duì)玉米蚜表現(xiàn)高抗，還表現(xiàn)出很高的一般配合力，是一個(gè)非常優(yōu)良的親本，已利用其配出多個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合參加玉米區(qū)域試驗(yàn)。

SLAF-seq技術(shù)是利用高通量測(cè)序發(fā)展而來(lái)的一套簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。與BSA分析相結(jié)合，在分子標(biāo)記開發(fā)上具有通量高、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在水稻、小麥、大豆等作物中已得到廣泛應(yīng)用[31-33]。但是，在玉米中的應(yīng)用比較晚。杜龍崗等[34]、吳向遠(yuǎn)[35]利用此方法分別對(duì)玉米果皮纖維素含量、玉米早衰性狀進(jìn)行了分析，獲得了與兩性狀相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)域，進(jìn)一步證實(shí)了此方法用于基因定位的可行性。本研究采用此方法對(duì)來(lái)自玉米自交系32t33的抗蚜性進(jìn)行分析，獲得了11 052 576個(gè)SNP位點(diǎn)(表5)，并將2個(gè)與抗蚜性關(guān)聯(lián)的區(qū)域分別定位在第3、第5染色體上。盡管前人分別利用抗蚜的Mo17、Ky21與不同的感蚜品種構(gòu)建的純系(RIL、NILs)在第1、第4、第5、第6、第7、第10染色體上定位了一些與玉米抗蚜性相關(guān)的位點(diǎn)(QTLs)[11-12]，但本研究定位的抗性位點(diǎn)與其位置不同，本研究發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)豐富了玉米抗蚜遺傳的基礎(chǔ)，新開發(fā)的SNP標(biāo)記可用于進(jìn)一步基因精細(xì)定位和分子標(biāo)記輔助育種。

表7 關(guān)聯(lián)區(qū)段的候選基因Table 7 The identification of candidate genes in associated regions

本研究在2個(gè)與抗蚜性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，篩選出5個(gè)與植物免疫、抗性有關(guān)的基因(表7)[36-37]。3個(gè)為編碼核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide bainding site，NBS)和富亮氨酸重復(fù)序列保守結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeat conserved domain，LRR)的受體蛋白(nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1,R proteins and CED-4，NB-ARC)或激酶(leucine rich repeat receptor-like kinases，LRR-RLK)基因，這2種基因在植物的防御系統(tǒng)中起著非常重要的作用[36-38]。雖然鮮見(jiàn)玉米抗性蛋白和激酶的基因?qū)τ衩籽辆哂锌剐缘膱?bào)道，但在番茄、甜瓜上分別克隆的Mi-1、Vat基因?qū)儆赗基因具有抗蚜功能[39-41]。此外，還有多個(gè)與抗蚜相關(guān)的位點(diǎn)也已被定位在NBS-LRR簇序列區(qū)域內(nèi)[42-44]。Song等[45]在玉米全基因組中鑒定出151個(gè)具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的基因和226個(gè)含有LRR-RLK結(jié)構(gòu)的基因，這對(duì)在抗蚜關(guān)聯(lián)區(qū)域篩選候選基因具有指導(dǎo)意義。除3個(gè)R基因外，還鑒定出2個(gè)與在擬南芥上參與植物免疫、抗逆性有關(guān)基因的同源基因(表7)。但這些候選基因?qū)ρ料x危害的應(yīng)答反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)從國(guó)內(nèi)外收集的玉米種質(zhì)資源的抗玉米蚜鑒定，篩選出高抗的玉米自交系32t33，其抗蚜性由隱性基因控制且表現(xiàn)數(shù)量性狀特征，采用SLAF測(cè)序技術(shù)與BSA分析相結(jié)合的方法開發(fā)出11 052 576個(gè)SNP標(biāo)記，獲得了2個(gè)與抗蚜性關(guān)聯(lián)的區(qū)域，并確定了5個(gè)候選基因。本研究結(jié)果豐富了玉米的抗蚜基因資源，開發(fā)的分子標(biāo)記可用于后續(xù)的基因精細(xì)定位，為最終分離出抗性基因，明確玉米的抗蚜的遺傳機(jī)制和應(yīng)用于玉米抗蚜品種選育奠定了基礎(chǔ)。